摘要
目的 肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）是全球癌症相关死亡的第三大主要原因。HCC由于其早期临床症状隐匿，通常发现时已经晚期且由于高其转移性导致HCC预后较差，治疗效果有限。目前，以手术为主辅以化疗和多靶点酪氨酸激酶抑制剂例如索拉非尼，瑞戈非尼的肝癌综合治疗已被广泛应用于临床，但HCC患者的5年生存率仍然很低。环状RNA（circRNA）的失调已被证明在各种癌症的发生发展中具有重要的调节作用。但是，circRNA在HCC中的生物学功能和潜在的分子机制仍然不清楚。 方法 1.筛选及鉴定circGSK3B，验证circGSK3B在肝癌中的表达和功能：首先从GEO数据库中筛选出circGSK3B，鉴定其环状结构并检测其细胞内定位。在肝癌组织和细胞系中证实circGSK3B高表达，功能实验表明高表达circGSK3B能够促进HCC进展。分析circGSK3B表达水平与HCC患者临床病理特征关系。 2.探究circGSK3B通过海绵miR-1265促进肝癌发生发展的分子机制：生信分析找出circGSK3B下游候选的miRNA及其靶基因，通过荧光素酶实验验证其相互结合来初步确定circGSK3B下游通路。在此基础上，通过FISH（RNA荧光原位杂交）实验证实circGSK3B与mi-1265共定位于细胞质，为circGSK3B具有miRNA海绵作用提供依据。验证miR-1265在肝癌中的低表达及对靶基因的负调控，功能实验验证miR-1265对肝癌的抑制作用。设计回复实验：通过westernblot验证circGSK3B对靶基因下游信号通路的正性调控作用；功能实验证实circGSK3B能通过海绵miR-1265促进肝癌发生发展。 3.探究肝癌中circGSK3B高表达与谷氨酰胺代谢的关系：首先在在细胞水平证实circGSK3B能使GLS（谷氨酰胺酶）表达上调，下一步在肝癌组织中验证circGSK3B与GLS表达正相关。在此基础上探究circGSK3B促进谷氨酰胺代谢，调控细胞内活性氧水平的作用。 结果 我们发现circGSK3B在HCC组织和HCC细胞系中高表达。另外，circGSK3B的表达水平与HCC肿瘤大小和血管浸润显著相关。在功能上，我们证实circGSK3B可以在体内和体外水平促进HCC细胞的增殖，迁移和侵袭。在机制上，我们证实circGSK3B可以充当miR-1265分子海绵，正向调控靶基因CAB39，并促进谷氨酰胺代谢，进而促进HCC的进程。最后，经典的RNA结合蛋白（RBP）QKI也参与circGSK3B的生物发生调控。 结论 总之，circGSK3B能够促进HCC细胞的增殖，迁移和侵袭以及谷氨酰胺代谢，这表明circGSKB有望成为HCC患者新的诊断和预后标志物，以及有潜力的治疗靶点。
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