摘要
研究背景：对乙酰氨基酚是目前应用最广泛的解热镇痛药物，其服用过量可造成严重的肝损害，甚至导致急性肝衰竭。在欧美国家对乙酰氨基酚过量是引起肝衰竭最常见的原因。在我国，对乙酰氨基酚引起的药物性肝损伤越来越引起临床重视，且肝损伤的严重程度和临床症状在不同个体之间差异很大。 目的：对对乙酰氨基酚诱发人体肝损伤进程中的外周血单个核细胞和肝细胞基因芯片中的差异表达基因进行生物信息学分析，寻找差异表达基因中的关键基因和差异表达基因富集的重要通路，为探究对乙酰氨基酚诱发肝损伤发生发展的病理生理机制提供理论基础。通过对筛选的关键基因进行初步实验研究，确定对乙酰氨基酚肝损伤进程中可能存在的早期生物标志物和遗传危险因素，为更深入地了解肝损伤机制，更早地改善肝损伤预后提供潜在研究价值。 方法：(1)生物信息学分析：1)筛选外周血单个核细胞和肝细胞基因芯片中的差异表达基因并使用DAVID在线分析工具和Cytoscape软件中的CluoGO插件分别对获取的差异表达基因进行GO功能注释和KEGG通路分析，获取差异表达基因所参与的重要生物学过程、分子功能、细胞组分和关键通路；2)利用STRING分析软件构建差异表达基因在蛋白互作层面的关系网络，并将网络数据导入Cytoscape软件中，利用其中的MCODE插件和cytoHubba插件分别挖掘关系网络中的疾病相关功能模块和核心基因。3)综合分析外周血单个核细胞和肝细胞基因芯片中的差异表达基因以获取乙酰氨基酚诱发肝损伤进程中，单个核细胞和肝细胞中共有的关键基因和重要通路。(2)实验研究：1)RT-qPCR检测药物性肝损伤和正常人外周血样本单个核细胞中基因NAMPT、NUSAP1、MKI67的mRNA表达水平。2)在对乙酰氨基酚处理小鼠不同时间点的肝细胞中，RT-qPCR检测基因NAMPT、NUSAP1、MKI67、ASPM、TOP2A、DLGAP5、NCAPG的mRNA表达水平，Westernblot检测DLGAP5和NAMPT的蛋白表达量。 结果：(1)生物信息学分析结果：1)对乙酰氨基酚诱发肝损伤的早期和晚期，外周血单个核细胞中差异表达基因的数量和种类发生了显著变化，P53信号通路在此变化过程中显著富集。2)对乙酰氨基酚诱发肝损伤过程中，肝细胞与外周血单个核细胞共有12个重叠的差异表达基因基因，其中有6个为筛选关键基因，补体与凝血级联通路在外周血单个核细胞中显著富集上调基因，在肝细胞中显著富集下调基因。3)对乙酰氨基酚进入人体后，诱导了外周血单个核细胞中基因NUSAP1、MKI67的表达显著上调，NAMPT先上调，后下调。4)对乙酰氨基酚在人体诱发急性肝衰竭的过程中，肝细胞中基因NAMPT的表达显著下调，NUSAP1、MKI67、ASPM、TOP2A、DLGAP5、NCAPG表达显著上调。(2)实验研究结果：1)药物性肝损伤血液样本单个核细胞中的基因NAMPT、NUSAP1、MKI67mRNA表达量较正常人增加。2)在对乙酰氨基酚处理小鼠不同时间点的肝细胞中，较0h，基因NAMPT的mRNA表达量降低，DLGAP5、NUSAP1、MKI67、NCAPG的mRNA表达量增加，但与对乙酰氨基酚作用时间无明显相关性；NAMPT蛋白表达量减少，且表现为对乙酰氨基酚作用时间相关性，DLGAP5蛋白表达量增加，且在肝损伤最严重的时间点增加较显著。 结论：(1)P53信号通路的活化可能与对乙酰氨基酚诱导细胞凋亡，加重组织损伤的毒理机制相关。(2)补体与凝血级联通路可能与对乙酰氨基酚诱发肝损伤的进展机制相关，但其具体作用机制还需进一步研究。(3)基因NAMPT、NUSAP1、MKI67的表达产物可作为机体暴露于对乙酰氨基酚中的外周血细胞标记物进一步考察和评估。(4)在小鼠肝细胞中，基因DLGAP5、NCAPG、MKI67、NUSAP1、NAMPT的表达变化可能与对乙酰氨基酚诱发肝损伤发生的进展机制相关。
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