摘要
背景：1-硝基芘（1-NP）是细颗粒物（PM2.5）的一种关键的组成成分。广泛存在于大气、土壤和水源中。先前的报告显示，急性1-NP暴露会引起呼吸道炎症。但是长期暴露于1-NP中的后果仍没有相关的研究和报告，本项研究旨在调查慢性1-NP暴露是否诱发肺纤维化及其其中可能存在的机制。 目的：探讨慢性1-NP暴露是否能够诱发小鼠发生肺纤维化并探索内质网应激在1-NP暴露诱导EMT和肺纤维化中的作用。 方法：动物实验：将购自北京维通利华的80只雄性C57BL6/J小鼠随机均分为两组：1-NP组和对照组。所有的小鼠均为6周龄，体重控制在20-22g。1-NP组小鼠用配制的1-NP溶液进行染毒（20μg/只/周）。对照组的处理用仅不含1-NP其余成分和比例完全相同的空白制剂处理。持续暴露六周，六周后两组中各留部分小鼠行肺功能检测，其余小鼠用颈椎脱臼法处死。处死后的小鼠开胸保留肺脏组织。随机每组选取部分左肺放置于4%多聚甲醛中保存。右肺保存在-80℃冰箱中。用HE染色观察小鼠肺部损伤及炎症弥漫程度，用免疫组织化学（IHC）检测小鼠上皮-间质转化（EMT）的标志物平滑肌肌动蛋白（a-SMA）分布及表达情况，用Masson染色测量测定肺部胶原沉积情况。 细胞实验：将未接受任何处理的人非小细胞肺癌细胞（A549）分为2个组：1-NP组、对照组。1-NP组细胞长期暴露于1-NP（5μM/L）,对照组暴露于含千分之一DMSO培养基中。培养6周后观察细胞形态变化,并进行一些细胞形态学的相关实验，主要有细胞划痕、细胞迁移及侵袭实验。提取细胞蛋白，用Westernblotting检测A549细胞中E-cadherin、波形蛋白（Vimentin）、N-cadherin、平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、磷酸化的Smad2/3的表达情况。留取细胞培养基上清用人TGF-βELISA试剂盒检测A549细胞TGF-β分泌情况。另外将一部分未经任何处理的A549细胞分为六组：6h组、12h组、24h组和6h对照组、12h对照组、24h对照组。用活性氧检测试剂盒检测细胞活性氧产生情况。提取细胞蛋白用Westernblotting检测A549细胞中磷酸化的IRE1α,PERK,eIF2α,GRP78,HO-1和NOX-4蛋白的表达量。 结果：在1-NP暴露的小鼠肺脏中观察到弥漫性间质性炎症,上皮-间质转化（EMT）的标志物α平滑肌肌动蛋白（a-SMA）阳性细胞，通过Masson染色发现实验组小鼠肺部大量胶原沉积。肺功能显示，在暴露于1-NP的小鼠中肺动态顺应性（Cydn-min）降低。此外，在暴露于1-NP的小鼠中，吸气阻力（Ri）和呼气阻力（Re）升高。从机制上讲，在1-NP暴露的A549细胞中细胞迁移和侵袭被加速。上皮标记物E-cadherin被下调，而1-NP暴露的肺非小细胞肺癌细胞中Vimentin，a-SMA和N-cadherin（三个间充质标记蛋白）被上调。尽管TGF-β没有改变，但磷酸化的Smad2/3在1-NP暴露的肺非小细胞肺癌细胞中却增强了。此外，在暴露于1-NP的肺上皮细胞中,活性氧增加，内质网应激被激活。 结论：长期暴露于1-NP会引起肺脏间质炎症，上皮间质转化和肺纤维化。其中活性氧诱发的内质网应激至少部分地导致了1-NP诱发的上皮间质转化和肺间质纤维化。
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