摘要
研究背景 肝纤维化（Liverfibrosis）是各种损伤因素引发的持续性损伤修复反应，导致肝组织内细胞外基质（Extracellularmatrix，ECM）的异常沉积，进一步引发肝脏结构和肝功能异常改变的一种病理过程。目前临床上肝纤维化的治疗效果不佳，严重危害人类的生命健康。因此，阐明肝纤维化的发病机制，具有重要临床意义。研究证实，活化的肝星状细胞（Hepaticstellatecells，HSCs）是肝脏合成ECM的主要细胞，肝星状细胞活化增殖是肝纤维化形成的中心环节。在各种损伤刺激下，HSCs由静止的、储存维生素A的细胞向增生的、成纤维的肌成纤维细胞的转分化，并分泌α-平滑肌肌动蛋白（Alpha-smoothmuscleactin，α-SMA）、I型胶原（CollagenI，Col1a1）等，产生促纤维化的细胞因子如转化生长因子（Transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1）、血小板源性生长因子（Plateletderivedgrowthfactor-BB，PDGF-BB）等现已被公认为肝纤维化的主要驱动因素。然而，到目前为止，关于调控HSCs增殖和肝纤维化发病的分子机制不详，因此，探究肝纤维化发病过程中HSCs增殖的分子作用机制对预防和治疗肝纤维化意义重大。 各种因素参与调控HSCs增殖，表观遗传修饰DNA甲基化是重要的表观遗传标记，在肝纤维化形成过程中起关键作用。本课题组研究发现DNA甲基化参与调控HSCs增殖，但是作为DNA甲基化转移酶之一的DNMT3A在肝纤维化的发病过程中起着怎样的调控作用，仍不明确。此外，研究表明，表观遗传学修饰长链非编码RNA（Longnon-codingRNA，LncRNA）具有调控HSCs增殖的作用，INK4基因座中反义非编码RNA（AntisenseNon-CodingRNAintheINK4Locus，ANRIL）是已知的具有调控细胞活化增殖功能的关键分子之一。文献报道LncRNAANRIL可通过介导细胞增殖通路相关蛋白的表达调控细胞增殖活性。但是，关于LncRNAANRIL如何调控HSCs增殖的具体分子机制不清，有待阐明。 基于DNMT3A与LncRNAANRIL两种表观遗传修饰方式如何调控HSCs增殖，两者之间相互作用、作用靶点和调控方式，需要深入阐明。本文将探究DNMT3A介导LncRNAANRIL甲基化在肝纤维化中的分子机制，以期为临床肝纤维化的治疗提供科学依据、新的分子诊断指标和干预靶点。 本研究收集临床肝纤维化患者血清及组织标本，并采用经典的四氯化碳（CCl4）皮下注射建立小鼠肝纤维化模型为体内研究对象，以肝星状细胞HSCs为体外研究对象，应用荧光原位杂交、甲基化特异性PCR（MSP）、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）荧光染色等技术，进行DNMT3A介导LncRNAANRIL甲基化在肝纤维化中的分子机制研究。 全文共分三个部分： 第一部分临床肝纤维化患者样本中DNMT3A、ANRIL、α-SMA、CollagenI的差异表达 目的： 阐明DNMT3A、ANRIL、α-SMA、CollagenI在临床患者肝纤维化样本中的差异表达。 方法： 选取安徽医科大学第二附属医院肝胆外科慢性肝病患者20例。所有患者均签署剩余标本使用知情同意书。分组：根据肝穿刺活检病理学诊断有无合并纤维化症状分为对照组（无纤维化组）和纤维化组各10例，肝穿刺活检病理学诊断参照《肝纤维化诊断及治疗共识（2019）》。并记录患者的相关信息，如年龄、性别等，严格按照安徽医科大学生物医学伦理委员会要求执行，收集血清及肝组织样本待测。 （1）检测肝纤维化患者血清中AST、ALT、HA的含量变化； （2）HE染色观察肝纤维化患者肝脏组织病理学改变； （3）Masson染色及天狼猩红染色观察肝纤维化患者肝脏组织胶原沉积改变； （4）Westernblotting及免疫组织化学实验检测DNMT3A、肝纤维化标志蛋白α-SMA、CollagenI在肝纤维化患者肝脏组织中的差异表达； （5）RT-qPCR检测DNMT3A、ANRIL、α-SMA、CollagenImRNA在肝纤维化患者肝脏组织中的差异表达。 结果： 1.临床患者肝纤维化组织中DNMT3A表达显著升高，ANRIL表达明显降低 （1）肝纤维化组血清中AST/ALT比值、HA的含量与对照组相比明显增加； （2）与对照组相比，肝纤维化组肝组织中胶原沉积明显增多、炎性浸润增加，纤维化改变显著； （3）肝纤维化组肝组织中DNMT3A、α-SMA、CollagenI蛋白的表达较对照组显著增高； （4）肝纤维化组肝组织中DNMT3A、α-SMA、CollagenImRNA的表达较对照组显著增高，而ANRILmRNA的表达则显著降低。 （5）相关性Preason分析结果显示：肝纤维化患者组织中DNMT3A和α-SMA的相对表达呈现明显正相关，ANRIL和α-SMA的相对表达呈现明显负相关。 小结：DNMT3A高表达与ANRIL低表达以及肝脏功能受损，可能与肝纤维化患者纤维化形成有关。 第二部分小鼠肝纤维化组织和肝星状细胞中DNMT3A、ANRIL、α-SMA、CollagenI的表达及ANRIL启动子区域甲基化水平 目的 进一步阐明小鼠肝纤维化组织和肝星状细胞中DNMT3A、ANRIL、α-SMA、CollagenI的表达及ANRIL启动子区域甲基化水平。 方法 1.30只雄性小鼠（18~22g）随机分为2组：正常组15只、CCl4处理组15只。自处理之日开始，除正常组给予橄榄油（1ml/kg）皮下注射外，其他各组小鼠皮下注射50%CCl4橄榄油溶液（1ml/kg）每周2次，共12周；直至第12周结束，建模过程中注意观察并记录小鼠体重变化，于造模满12周时，麻醉后留取肝脏组织和血液标本，检测相关指标。 （1）检测肝纤维化小鼠血清中AST、ALT、HA、TGF-β1的含量变化； （2）HE染色观察小鼠肝纤维化组织病理学改变； （3）Masson染色及天狼猩红染色观察小鼠肝纤维化组织胶原沉积改变； （4）Westernblotting及免疫组织化学实验检测DNMT3A、α-SMA、CollagenI蛋白在小鼠肝纤维化组织中的表达； （5）RT-qPCR检测DNMT3A、ANRIL、α-SMA、CollagenImRNA在小鼠肝纤维化组织中的表达； （6）FISH检测ANRIL在小鼠肝纤维化组织中的表达； （7）MSP检测小鼠肝纤维化组织中ANRIL启动子区域甲基化水平。 2.体外以肝星状细胞HSCs为研究对象，使用细胞因子TGF-β1（5ng/ml）诱导刺激HSCs增殖，建立体外HSCs增殖模型，进行以下实验： （1）检测TGF-β1处理HSCs后上清液中HA和PIIIP的含量变化； （2）Westernblotting及免疫荧光实验检测DNMT3A、α-SMA、CollagenI蛋白在TGF-β1处理HSCs中的差异表达； （3）RT-qPCR检测DNMT3A、ANRIL、α-SMA、CollagenImRNA在TGF-β1处理HSCs中的差异表达； （4）应用MTT、CCK8以及BrdU荧光染色检测观察TGF-β1处理对HSCs增殖的影响； （5）BSP检测TGF-β1处理HSCs后ANRIL启动子区域甲基化位点变化。 结果： 1.小鼠肝纤维化组织中DNMT3A表达显著增高，ANRIL表达显著降低，ANRIL表达降低可能与ANRIL基因启动子区域甲基化水平升高有关。 （1）肝纤维化小鼠血清中AST/ALT比值、HA、TGF-β1含量水平较对照组明显增高； （2）与对照组相比，小鼠肝纤维化组织中胶原沉积增多、炎性浸润增加、纤维化改变明显； （3）与对照组相比，DNMT3A、α-SMA、CollagenI蛋白和mRNA的表达在小鼠肝纤维化组织中显著增高，而ANRILmRNA在小鼠肝纤维化组织中的表达显著降低； （4）小鼠肝纤维化组织中ANRIL启动子区域甲基化水平与对照组相比显著升高。 2.体外HSCs增殖模型中，DNMT3A高表达，ANRIL低表达，ANRIL的低表达可能与ANRIL启动子区域甲基化水平升高有关 （1）TGF-β1处理后HSCs细胞上清液中HA和PIIIP的含量较对照组明显增高； （2）与对照组相比，TGF-β1诱导刺激HSCs（24h、48h）后HSCs增殖活性明显增强； （3）与对照组相比，DNMT3A、α-SMA、CollagenI蛋白和mRNA的表达在TGF-β1诱导刺激HSCs中显著增高，而ANRILmRNA的表达显著降低； （4）同时，TGF-β1诱导刺激HSCs中ANRIL启动子区域甲基化水平较对照组显著升高。 小结：DNMT3A高表达与ANRIL高甲基化修饰导致的ANRIL表达下调，可能与小鼠肝纤维化形成和HSCs增殖有关。但是关于DNMT3A与ANRIL如何调控肝纤维化形成和HSCs增殖，两者之间有何调控作用，仍不清楚，值得进一步研究。 第三部分DNMT3A介导ANRIL甲基化在肝纤维化与HSCs增殖中的分子作用机制 目的： 探究DNMT3A介导ANRIL甲基化调控HSCs细胞增殖及肝纤维化的分子机制。 方法： 1.60只雄性小鼠（18~22g）随机分为4组：正常组，CCl4处理组，CCl4+LV3慢病毒空载体组，CCl4+LV3-DNMT3A慢病毒组，每组各15只。自处理之日开始，除正常组给予（1ml/kg）剂量橄榄油皮下注射外，其他各组小鼠皮下注射50%CCl4橄榄油溶液（1ml/kg）每周2次，共12周；于造模满11周后，LV3慢病毒空载体组小鼠，LV3-DNMT3A慢病毒组小鼠，分别给予30μl慢病毒空载体LV3和30μl慢病毒LV3-DNMT3A尾静脉注射处理（慢病毒颗粒的滴度为1×109TU/ml），一周后处死小鼠，留取肝脏组织和血液标本，检测相关指标。 （1）HE染色观察重组慢病毒DNMT3A干预后小鼠肝纤维化组织病理学改变； （2）Masson染色及天狼猩红染色观察重组慢病毒DNMT3A干预后小鼠肝纤维化组织胶原沉积改变； （3）Westernblotting及免疫组织化学实验检测重组慢病毒DNMT3A干预后，DNMT3A、α-SMA、CollagenI蛋白在小鼠肝纤维化组织中的表达变化； （4）RT-qPCR检测重组慢病毒DNMT3A干预后，DNMT3A、ANRIL、α-SMA、CollagenImRNA在小鼠肝纤维化组织中的表达变化； （5）FISH检测重组慢病毒DNMT3A干预后，ANRIL在小鼠肝纤维化组织中的表达变化。 2.细胞实验：应用DNMT3A过表达质粒、DNMT3A小干扰RNA以及DNA甲基转移酶抑制剂2''-脱氧-5-氮杂胞嘧啶（5-aza-2''-deoxycytidine，5-AzadC）1μmol/L分别转染处理TGF-β1（5ng/ml）刺激24h后的HSCs，实验分组：对照组，TGF-β1（5ng/ml）处理组，TGF-β1（5ng/ml）+DNMT3A过表达质粒处理组，TGF-β1（5ng/ml）+DNMT3A小干扰RNA处理组，TGF-β1（5ng/ml）+5-AzadC（1μmol/L）处理组，并进行以下实验： （1）Westernblotting检测DNMT3A、α-SMA、CollagenI蛋白在DNMT3A过表达质粒、DNMT3A小干扰RNA以及5-AzadC（1μmol/L）干预处理后HSCs中的表达变化； （2）RT-qPCR检测DNMT3A、ANRIL、α-SMA、CollagenImRNA在DNMT3A过表达质粒、DNMT3A小干扰RNA以及5-AzadC（1μmol/L）干预处理后HSCs中的表达变化； （3）应用MTT、CCK8以及BrdU荧光染色检测观察DNMT3A过表达质粒、DNMT3A小干扰RNA以及5-AzadC（1μmol/L）处理后对HSCs增殖的影响。 3.应用ANRIL过表达质粒、ANRIL小干扰RNA转染处理TGF-β1（5ng/ml）刺激24h后的HSCs，实验分组：对照组，TGF-β1（5ng/ml）处理组，TGF-β1（5ng/ml）+ANRIL过表达质粒处理组、TGF-β1（5ng/ml）+ANRIL小干扰RNA处理组；并进行以下实验： （1）Westernblotting检测ANRIL过表达质粒、ANRIL小干扰RNA分别处理活化增殖的HSCs中α-SMA、CollagenI、AMPK、Phospho-AMPK（p-AMPK）蛋白的表达变化； （2）RT-qPCR检测ANRIL过表达质粒、ANRIL小干扰RNA分别处理活化增殖的HSCs中ANRIL、α-SMA、CollagenImRNA的表达变化； （3）应用MTT、CCK8以及BrdU荧光染色观察ANRIL过表达质粒、ANRIL小干扰RNA对HSCs增殖的影响。 结果： 1.重组慢病毒DNMT3A干预后，ANRIL的表达明显升高，小鼠肝纤维化程度明显改善 （1）与对照组相比，小鼠肝纤维化组织中胶原沉积增多、炎性浸润增加、纤维化改变明显，给予重组慢病毒DNMT3A干预后，与慢病毒空载体组相比，肝脏细胞结构改善、胶原纤维减少，肝组织纤维化病理改善更为明显； （2）与对照组相比，小鼠肝纤维化组织中DNMT3A、α-SMA、CollagenI蛋白和mRNA的表达显著增高，给予重组慢病毒DNMT3A干预后，与慢病毒空载体组相比，小鼠肝纤维化组织中DNMT3A、α-SMA、CollagenI蛋白和mRNA的表达明显减少； （3）然而，与对照组相比，ANRILmRNA在小鼠肝纤维化组织中的表达显著降低，给予重组慢病毒DNMT3A干预后，与慢病毒空载体组相比，小鼠肝纤维化组织中ANRILmRNA的表达明显升高。 2.体外HSCs增殖模型中，过表达DNMT3A可显著抑制ANRIL表达，促进HSCs增殖；而沉默DNMT3A可明显促进ANRIL表达，抑制HSCs增殖；提示DNMT3A通过负调控ANRIL的表达影响HSCs增殖活性 （1）与阴性对照组相比，转染DNMT3A小干扰RNA处理后HSCs中DNMT3AmRNA表达显著降低，而ANRILmRNA表达显著增高。 （2）然而，与空质粒组相比，转染DNMT3A过表达质粒后HSCs中DNMT3AmRNA表达明显增高，而ANRILmRNA表达明显降低。 （3）与TGF-β1刺激组相比，使用DNA甲基化抑制剂5-AzadC处理HSCs后ANRIL表达水平明显升高。 （4）与空质粒组相比，转染DNMT3A过表达质粒后HSCs增殖活性明显增强； （5）与阴性对照组相比，转染DNMT3A小干扰RNA后可明显抑制HSCs增殖；此外，与TGF-β1刺激组相比，5-AzadC处理后可明显抑制HSCs增殖。 3.过表达ANRIL能明显抑制AMPK蛋白磷酸化水平，同时可显著降低HSCs的增殖活性；沉默ANRIL可显著增加AMPK蛋白磷酸化水平，同时可显著促进HSCs的增殖活性； （1）与空质粒组相比，ANRIL过表达质粒转染HSCs后ANRIL表达显著升高，而α-SMA、CollagenI、p-AMPK表达明显降低； （2）另外，与空质粒组相比，ANRIL过表达质粒转染后明显抑制HSCs增殖。 （3）然而，与阴性对照组相比，ANRIL小干扰RNA转染HSCs后ANRIL表达显著降低，而α-SMA、CollagenI、p-AMPK表达明显增高； （4）与阴性对照组相比，ANRIL小干扰RNA转染后明显促进HSCs增殖。小结：LncRNAANRIL可能因DNMT3A介导的高水平甲基化修饰而表达下调，使得ANRIL对AMPK信号通路核心蛋白AMPK的抑制作用减弱，AMPK蛋白磷酸化水平升高，激活AMPK信号通路，HSCs增殖活性增强，促进肝纤维化的形成。 结论： 1.DNMT3A高表达与LncRNAANRIL低表达以及肝脏功能受损，可能与肝纤维化形成有关。 2.DNMT3A高表达与LncRNAANRL发生高甲基化修饰导致ANRIL表达下调，可能与肝纤维化形成和HSCs增殖有关。 3.LncRNAANRIL可能因DNMT3A介导的高甲基化修饰而表达下调，使得ANRIL对AMPK信号通路核心蛋白AMPK的抑制作用减弱，AMPK蛋白磷酸化水平升高，激活AMPK信号通路，HSCs增殖活性增强，促进肝纤维化的形成。
NETL