摘要
研究背景 系统性红斑狼疮（systemiclupuserythematosus，SLE）是一种复杂的慢性自身免疫性疾病，由自身免疫介导，以多种异常的自身抗体产生，多系统和多器官受累，临床表现多样化为主要疾病特点。SLE患者的预后较差，生存质量低，病死率较高，发病率攀升，多侵害育龄期女性。然而，SLE的发病机制至今尚未明确。遗传因素研究为揭示SLE的病理机制做出了巨大努力，但仍不足以解释SLE复杂的临床表现和治疗难题。 近些年，表观遗传学修饰为探索SLE复杂的机制、诊断、治疗和预防提供了新思路。多种表观遗传机制在SLE中发生，如DNA甲基化修饰介导淋巴细胞发育，非编码RNAs调控免疫细胞，染色质重塑和组蛋白修饰等。这些表观遗传学调控在不改变任何DNA序列前提下，使基因功能发生可遗传变化，最终导致疾病表型发生改变。 与DNA修饰和蛋白质修饰一样，发生在RNA水平上的转录后基因表达调控机制——N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修饰被扰乱后，可能导致RNA表达异常。m6A修饰是指在RNA腺嘌呤第六位的氮原子上发生了甲基化，并调控其基因表达。该种修饰是人类mRNA中广泛存在的一种修饰方式，由特定的甲基转移酶催化形成，在去甲基化酶催化下去除修饰，并在识别蛋白读取m6A修饰所蕴含的信息下，把修饰信息转化为功能信号。在这些m6A甲基化酶的共同作用下，使RNA发生甲基化和去甲基化的动态变化，从而调节机体的各种生物学功能。 m6A修饰位点主要分布在转录起始、基因内部编码区和3’-UTR等重要功能区域。已有研究表明，m6A修饰参与细胞代谢调控、胚胎干细胞分化、昼夜节律和细胞凋亡等多种生物学过程。越来越多的证据提示，m6A修饰在免疫应答调控机制和炎症调控网络上被认为是T细胞稳态、细菌或病毒感染后免疫反应的重要调节因子。在SLE中，ALKBH5去甲基化酶已被报道是炎症反应标志物，YTHDF2识别蛋白与SLE疾病活动度有关，但仍需要深入探讨m6A修饰在SLE疾病中的作用机制。 m6A修饰在疾病过程，乃至疾病治疗和预后都有可能扮演着重要角色，有望成为治疗和预防疾病的新干预靶点。然而，m6A修饰在SLE中的研究仍十分有限，需要进一步研究。 目的 借助甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量测序（MethylatedRNAImmunopre-cipitationsequening，MeRIP-seq）技术建立SLE疾病mRNA的m6A修饰谱和表达谱，初步筛选m6A修饰相关mRNAs，并进行人群验证。对差异表达的m6A修饰相关mRNAs进行T细胞相关功能研究，初步揭示mRNA的m6A修饰在SLE疾病过程中的作用。 在建立的SLE疾病mRNAs表达谱中筛选目前已经报道的m6A甲基化酶，并选择m6A甲基转移酶进行人群验证。对差异表达的甲基转移酶进行功能研究，初步揭示m6A甲基转移酶在SLE疾病中的作用及其机制。 方法 本课题采用的是病例对照设计，研究共分四个阶段： （1）第一阶段是建立SLE疾病中mRNAs的m6A修饰谱和表达谱 在3例新发未服药的SLE患者和3例匹配的对照外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）中利用MeRIP-seq建立mRNAs的m6A修饰谱和表达谱。对差异表达和差异修饰的mRNAs进行GO富集分析（GeneOntology，GO）和KEGG富集分析（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）以及关联分析，筛选4个潜在的m6A修饰相关mRNAs，即IFIT5、CSF3R、SP140和IFIH1。在表达谱中筛选目前已经报道的m6A甲基化酶，从中找出m6A甲基转移酶（METTL3、METTL14、METTL16和WTAP）。 （2）第二阶段SLE患者与对照PBMC中m6A修饰相关mRNAs和甲基转移酶表达验证 借助实时定量聚合酶链反应（quantitativeReal-timePolymeraseChainReactionq，qRT-PCR）技术，在108例SLE患者和110例对照的PBMC中进行4种m6A修饰相关mRNAs（IFIT5、CSF3R、SP140和IFIH1）和4种m6A甲基转移酶（METTL3、METTL14、METTL16和WTAP）的基因表达水平验证；结合临床信息，对差异表达的基因与SLE的临床表现、实验室指标和药物治疗等进行关联分析；借助免疫印迹实验（westernblot，WB）技术，在40例SLE患者和40例对照PBMCs中对差异表达的IFIT5和CSF3R以及甲基转移酶METTL3的蛋白水平进行验证。 （3）第三阶段SLE患者与对照T细胞中m6A修饰相关mRNAs和METTL3表达验证 借助qRT-PCR技术和WB实验在独立重新收集的32例SLE患者和32例对照T细胞中对在PBMC中差异表达的IFIT5、CSF3R和甲基转移酶METTL3的基因表达水平和蛋白水平进行T细胞验证；结合临床信息，分析了IFIT5、CSF3R和METTL3的表达水平与SLE临床特征和药用使用的相关性。 （4）第四阶段细胞实验验证m6A修饰相关mRNA和METTL3对SLE患者T细胞功能的影响 选用pLKD-CMV-EGFP-2A-Puro-U6-shRNA干扰载体构建了IFIT5干扰的Jurkat细胞株，用pLKD-CMV-EGFP-2A-Puro-U6-shRNA干扰载体构建了METTL3干扰的Jurkat细胞株，用pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-METTL3-WPRE过表达载体构建了METTL3过表达的Jurkat细胞株。借助流式细胞仪检测技术，在AnnexinV-PE和7-Amino-ActinomycinD双染色后检测IFIT5沉默、METTL3沉默和过表达后分别对Jurkat细胞凋亡的影响；用EDU检测IFIT5沉默、METTL3沉默和过表达后分别对Jurkat细胞在0h、6h、12h和24h时对细胞周期的影响。 结果 （1）SLE疾病中mRNA表达谱和m6A修饰谱分析 本课题通过MeRIP-seq建立了SLE疾病mRNA的表达谱和m6A修饰谱，发现SLE中m6A甲基化水平低于对照组。SLE病例组与对照组均能检测到peaks峰的基因有6293个，有2137个差异peaks分布在1943个基因中，这些peaks峰集中分布在3’UTR和CDS交界处。在SLE病例中预测到了经典的Motifs（RRACH，R=A/G，H=A、T、C）。差异基因与差异peak关联分析后，从中筛选4个潜在的m6A修饰相关的mRNAs（IFIT5、CSF3R、SP140和IFIH1）进行验证。另外，在SLE疾病中发现m6A修饰酶共20种，其中验证了m6A甲基转移酶（METTL3、METTL14、METTL16和WTAP）。 （2）SLE患者与对照PBMC中m6A修饰相关mRNAs和甲基转移酶表达情况 在扩大样本人群的PBMC中验证发现，与对照组相比，CSF3R和IFIT5的表达水平和蛋白水平在SLE患者中存在统计学差异，其中CSF3R表达水平和蛋白水平均下调（均有Plt;0.05），IFIT5的表达水平和蛋白水平均上调（均有Plt;0.05）。与临床信息的关联研究结果显示，在SLE患者白细胞减少时，IFIT5的表达水平上调（Z=-2.557，P=0.011），在抗SSB抗体阳性时表达降低（Z=-2.357，P=0.018），在患者服用羟氯喹药物组表达水平升高（Z=-2.913，P=0.004）。CSF3R的表达水平与SLE患者ESR水平呈负相关（rs=-0.217，P=0.042）。另外，与对照相比，4种m6A甲基转移酶（METTL3、METTL14、METTL16和WTAP）的表达水平在SLE患者中均表达下调（均有Plt;0.05）。其中，METTL16表达水平在SLE患者出现蛋白尿时降低（Z=-1.966，P=0.049）；WTAP表达水平在SLE患者白细胞减少时升高（Z=-2.049，P=0.040）且在患者出现抗小核抗体（anti-nucleosomeantibody，AnuA）阳性时也升高（Z=-1.992，P=0.046）；METTL3表达水平与SLE患者的CRP大小呈负相关（rs=-0.223，P=0.036）；METTL3与WTAP的表达水平与患者使用糖皮质激素有关（均有Plt;0.05）；METTL14和METTL16的表达水平与SLE患者服用羟氯喹药物均存在统计学关联（均有Plt;0.05）。为了进一步验证甲基转移酶的功能，我们选择METTL3进一步验证。WB验证结果显示，METTL3在SLE患者PBMC中的蛋白水平比对照低。 （3）SLE患者与对照T细胞中m6A修饰相关mRNAs和METTL3表达情况 T细胞验证发现，与对照相比，IFIT5的表达水平和蛋白水平在SLE患者中依然是上调（均有Plt;0.05）；CSF3R的蛋白水平在SLE患者中依然下调（Plt;0.05）。与临床信息关联研究结果显示，CSF3R的表达水平与SLE患者白细胞减少存在关联（Z=-2.014，P=0.044），同时与C3补体水平呈负相关（rs=-0.400，P=0.028）。IFIT5表达水平在SLE患者出现脓尿时升高（Z=-2.590，P=0.010），还与SLE患者疾病活动度呈正相关（rs=0.388，P=0.028）。与对照相比，METTL3在T细胞中的表达水平和蛋白水平仍然在SLE患者中下调（均有Plt;0.05）。与临床信息关联分析结果显示，METTL3在SLE患者T细胞中的表达水平与抗dsDNA抗体存在统计学关联，在患者抗dsDNA抗体升高时表达水平降低（Z=-2.439，P=0.015），抗SSB/La阳性时表达水平同样降低（t=3.181，P=0.007），同时与SLE患者补体C3和C4水平均呈正相关（C3，rs=0.496，P=0.004；C4，rs=0.430，P=0.014）。 （4）差异表达的m6A修饰相关mRNA和METTL3对T细胞的影响 细胞实验结果显示，Jurkat细胞株慢病毒感染效率达到90%。与阴性对照相比，IFIT5基因干扰后Jurkat细胞凋亡比例上升（13.6%vs24.0%），细胞增殖能力下降。与阴性对照相比，METTL3基因沉默后加速Jurkat细胞凋亡，尤其是细胞早期凋亡（21.2%vs44.0%），同时Jurkat细胞增殖能力明显受到抑制；METTL3过表达后，Jurkat细胞凋亡速度变缓（18.6%vs9.56%）且细胞增殖能力增强。 结论 （1）本课题发现，与对照相比，SLE疾病中m6A甲基化水平降低。m6A修饰peaks峰主要集中在终止密码子附近，同时在SLE病例中发现了经典的甲基化结合位点Motifs。研究初步揭示了m6A修饰可能参与SLE的疾病过程。 （2）CSF3R和IFIT5在SLE中明显异常表达，其中IFIT5干扰后Jurkat细胞凋亡比例上升且细胞增殖能力下降。研究初步发现m6A修饰相关的mRNAs可能影响T细胞稳定性，但其中具体的调控机制仍需进一步研究。 （3）本课题发现，SLE疾病中存在多种m6A甲基化酶，其中包括甲基转移酶、去甲基化酶和识别蛋白，因此m6A修饰可能动态调控SLE的疾病过程。甲基转移酶在SLE疾病中均呈现表达下调，其中METTL3与SLE患者临床指标和治疗药物均存在关联。对METTL3基因干扰和过表达后发现，METTL3表达下调会促进Jurkat细胞凋亡，抑制T细胞增殖能力。METLL3和其它差异表达的m6A甲基化酶在SLE疾病中的作用及其机制值得更深入探讨。
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