摘要
蓝莓（Vacciniumspp.）适宜生长在pH值为4.0~5.5的酸性土壤中，对根际土壤具有明显的“嗜酸性”。但目前我国许多蓝莓种植地区土壤pH在5.5以上，不适应蓝莓生长，这在一定程度上限制蓝莓产业发展。植物根系PMH+-ATPase（PlasmaMembraneH+-ATPase，HA）能将细胞内H+分泌到胞外，从而达到酸化根际土壤的作用，以适应非酸性根际胁迫。但蓝莓VcHAs的表达量在非酸性根际环境下未见适应性上调，而其相关调控机制却尚未报道，可见从启动子、转录因子角度解析蓝莓VcHAs的转录调控机理具有重要意义。 本研究通过启动子全长活性分析及5’端缺失分析，探究蓝莓VcHAs基因启动子响应非酸性根际胁迫响应区域，再通过生物信息学预测、酵母单杂交、双荧光素酶报告基因检测系统检测及遗传转化拟南芥等筛选相关的转录因子及验证其功能，探究蓝莓中响应非酸性根际胁迫的转录调控机制。为揭示蓝莓“嗜酸性”的相关机制及进一步提高蓝莓在非酸性根际胁迫条件下的抵抗力，具体研究结果如下： 分离克隆9个VcHAs启动子（pVcHAs），通过生物信息学分析发现这些启动子分布有光响应、干旱响应、低温响应及激素响应等非生物胁迫相关的顺式作用元件，表明VcHAs受到多种环境因素的调控；pVcHAs融合LUC报告基因于烟草叶片上进行瞬时表达发现9个VcHAs启动子均有活性，但活性强弱不一。 关键基因VcHA11.1启动子5’端缺失分析发现，相较于pH5.0时，缺失启动子在pH7.0时活性显著上调，表明该启动子活性能够响应非酸性根际胁迫；但当pH增加至8.0时启动子活性下降，甚至低于pH5.0时的活性，这可能是由于过高的pH不适宜烟草的生长，导致整体表达水平偏低。在pH5.0与pH7.0处理下，pVcHA11.1、pVcHA11.1-A、pVcHA11.1-B活性无显著差异，而当启动子片段由pVcHA11.1-B缩短至pVcHA11.1-C时，启动子活性发生显著性降低，降幅最大达到32.0%，表明pVcHA11.1上-712~-438bp的缺失导致转录水平的显著降低。另外，pH7.0处理下pVcHA11.1-C（-438~+124bp）的活性相较于pH5.0有显著提高，这暗示着其中可能也存在尚未发现的非酸性根际胁迫响应元件。 通过生物信息学预测出VcHA11.1可能的调控转录因子：VcDof2.1与VcbHLH104。酵母单杂交与烟草双荧光素酶实验证实VcDof2.1与VcbHLH104转录因子能直接作用在pVcHA11.1-B。对蓝莓进行不同pH处理30天后，其表型出现了较为明显的差异。实时荧光定量PCR表明，蓝莓根部VcbHLH104的表达在pH7.0时达到最高，提高了242.0%，而当pH升高至8.0时，其表达显著降低；VcbHLH104表达与其靶基因VcHA11.1表达趋势相一致，表明VcHA11.1和VcbHLH104表达会受到非酸性根际胁迫的诱导，推测VcbHLH104正向调控VcHA11.1表达；VcDof2.1在根部的表达随着pH升高而降低，表明非酸性根际环境会抑制VcDof2.1在根部的表达。 PCR扩增得到951bpVcDof2.1和672bpVcbHLH104基因的cDNA全长序列，分别编码317、224个氨基酸。同源性分析和构建系统发育进化树发现，发现蓝莓VcDof2.1、VcbHLH104分别与茶树（Camelliasinensis）、中华猕猴桃（ActinidiachinensisPlanch）同源性高，亲缘关系较近。遗传转化拟南芥后发现VcbHLH104基因能提高植株抵抗非酸性根际胁迫能力。 综上所述，蓝莓质膜H+-ATPase基因VcHA11.1表达能够响应非酸性根际胁迫，VcDof2.1和VcbHLH104转录因子直接结合在核心响应区域pVcHA11.1-B（-712~+124bp），VcbHLH104正向调控VcHA11.1表达，且VcbHLH104一定程度上能够促进拟南芥在非酸性根际胁迫条件下的抵抗力，初步在转录水平上揭示了蓝莓非酸性根际胁迫响应机制。
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