摘要
骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是一种严重困扰中老年健康的代谢性骨病，目前还没有理想的治疗药物，虽然双膦酸盐已非常普及，但其口服的吸收性不好，并且有明显的副作用。因此，寻找新的安全有效的抗骨质疏松药物仍是一项当务之急。近年来，中草药因其成本低、易获取、副作用小等特点而在骨质疏松防治方面引起人们的浓厚兴趣，相关文献报道呈快速增长之势。本论文根据文献报道和前期研究结果选取淫羊藿苷（ICA）、松脂醇二葡萄糖苷（PDG）、木香烃内酯（COS）和去氢木香内酯（DEH）四种中草药单体，比较研究了它们对体外培养大鼠乳鼠颅骨成骨细胞（ROBs）成骨性分化的影响，在确定其中最优者后对其促进成骨活性的信号通路进行了研究，以期为开发抗骨质疏松新药奠定基础。 本论文的主要实验方法和步骤如下：1.应用酶解法对出生48h内的大鼠乳鼠颅骨成骨细胞进行提取、分离和培养；2.ICA、PDG、COS和DEH均采用6种浓度（0、1?10-5、1?10-6、1?10-7、1?10-8、1?10-9mol/L）进行比较研究，以碱性磷酸酶（ALP）活性、成骨相关基因和蛋白表达量为衡量指标，筛选确定最佳单体化合物；3.应用组织化学染色法，探究最佳单体化合物对成骨细胞形成ALP染色阳性克隆和钙化结节的影响；4.用Westernblot和Realtime-PCR研究最佳单体化合物对成骨相关BMP-2、RUNX-2、CollagenⅠ和OSX基因与蛋白表达量的影响；5.用Westernblot、Realtime-PCR和免疫荧光染色技术来探索最佳单体对Wnt和BMP-2信号通路活性的影响。 以上实验得到的主要结果如下：1.根据对ALP活性的影响，以PDG对ALP活性的提高幅度最大，ICA居其次。2.ICA、PDG和COS均可提高ROBs成骨性标志蛋白的表达量，只有DEH无明显效果。基因表达检测结果与蛋白相似。总体而言，PDG的提高效果最高最稳定。3.PDG可显著增加ROBs形成的ALP染色阳性克隆和钙化结节数量（P＜0.01）。4.用PDG处理ROBs24h后，OSX、OCN和CollagenⅠ的基因表达量显著高于对照组，48h后OSX和CollagenⅠ的表达量开始下降。5.PDG处理ROBs24h后，Wnt10b和β-catenin的蛋白表达量均升高，β-catenin发生了明显的核转位；BMP-2信号通路中的BMP-2与RUNX-2在PDG处理24h后表达量增高，48h后BMP-2进一步升高但RUNX-2略有下降。 上述实验结果表明，在ICA、PDG、COS和DEH四种中药单体中，以PDG促进体外培养成骨细胞骨形成的效果最好。最佳浓度（1?10-6mol/L）的PDG显著提高ROBs的ALP活性，ALP染色染色阳性克隆和钙化结节数量，促进成骨相关基因和蛋白的表达。PDG既激活了Wnt信号通路，又提高了BMP-2信号通路活性，说明其促进成骨活性可能是在两条途径的协同作用下完成的。
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