摘要
溶酶体是一种重要的亚细胞器，在细胞内信号传导、维持体内稳态、降解生物大分子等方面发挥重要作用。溶酶体功能异常易导致溶酶体贮积性疾病及肿瘤的侵袭和转移，如胰腺导管腺癌（PDAC）肿瘤表现出高溶酶体活性，溶酶体低表达可抑制PDAC细胞的增殖和肿瘤的生长。因此，开发可视化示踪溶酶体靶向探针，对监测溶酶体的体内活性及相关疾病诊疗具有重要意义。现有的溶酶体荧光可视探针存在易光降解、较强生物毒性、溶酶体扩散等，是活细胞成像及可视化溶酶体研究中亟须解决的问题。碳点（CDs），由于其良好的光稳定性、生物相容性、光催化性，成为生物成像的一颗新星。目前，用于生物成像的碳点由于发射波长较短，集中在蓝光区域，存在干扰细胞成像，对活体组织及细胞造成光辐射损伤等问题。因此，构建一种光学性质稳定，波长发射较长的荧光碳点是生物成像并扩大其生物应用的关键。 基于溶酶体中存在较多酸性水解酶及极性较大的特点，本文设计了具有较强极性，具有与溶酶体作用的供电子含氮官能团，且为生物内源性物质作为前体，采用一步水热法绿色合成多色荧光碳点，构建了具有高选择性、高荧光量子产率、较强的光学稳定性的碳点基荧光探针体系及高负载量的载药体系。并对这些体系分别进行溶酶体标记、生物成像和药物递送等应用研究，探究了多色荧光碳点的细胞内化机制，实现了自体靶向溶酶体成像、肿瘤靶向、活体成像及药物递送一体化监测。具体研究内容如下： ①谷胱甘肽荧光探针体系的构建及其在溶酶体靶向、细胞成像、药物递送中的应用研究 1）选取等电点在酸性范围，极性较大的内源性物质谷胱甘肽为前体，通过水热法自体钝化形成异元素掺杂、光稳定性好、低毒性的多色荧光碳点（GSH-CDs）。该碳点平均粒径为2nm，表面富含羟基、羧基、六元氮杂环等官能团，为溶酶体成像提供了靶向基团，同时具有低细胞毒性、良好的血液相容性、抗光漂白性和盐稳定性好的特征。GSH-CDs具有激发波长依赖性，可应用于多色细胞成像：在正常细胞中，荧光分布于细胞质，而在肿瘤细胞中则分布于整个细胞，因此，可识别正常细胞和肿瘤细胞。进一步研究表明GSH-CDs和LysoRed-Tracker的荧光重叠性良好，可靶向溶酶体，且具有一定的通用性。细胞内化机制实验表明GSH-CDs通过小窝蛋白/网格蛋白介导的内吞途径进入细胞，并通过溶酶体固胺作用，实现了溶酶体靶向成像，并成功应用于斑马鱼活体成像。为未来的药物靶向性研究和疾病肿瘤作用靶点的定位提供研究方向。 2）基于GSH-CDs的荧光特性，构建了具有荧光示踪能力的GSH-CDs-DOX载药体系。实验表明，该体系负载率高达88.65%，负载量为44.3mg/g。药物体外释放72h，pH=5.0时累计释放率为75.43%，是pH7.4条件下的5.2倍。此现象归因于GSH-CDs表面羧基质子化，与DOX之间的静电吸附作用减弱，表明该载药体系具有pH敏感性。相较于对照组，载药体系对肿瘤细胞有强抑制作用，细胞存活率低至69.9%；对正常细胞无明显杀伤作用（存活率为94%）。同时载药体系可将DOX递送在细胞核中，抑制细胞生长。由此可见，该载药体系具有肿瘤细胞靶向性，可用于肿瘤靶向治疗和药物体内示踪。 ②麦芽糖-色氨酸荧光探针体系的构建及其生物应用研究 1）选取麦芽糖为碳源，等电点为酸性范围，具有供电子基团，更高生物活性的色氨酸为掺杂氮源，通过温和绿色的水热合成法制备氮掺杂荧光碳点（MS-CDs）。该碳点相较于GSH-CDs，引入氮杂环供电子基团，使发射波长红移45nm，表面氮含量增加0.54%，荧光量子产率提高7.78%，荧光寿命增加0.563ns，证明通过掺杂氮杂环基团，改善了碳点的光致发光性质。较低浓度MS-CDs在正常细胞及肿瘤细胞均分布于细胞质中，细胞形态完好，可作为多色细胞成像和体内细胞质成像探针，具有广谱性。正常细胞和肿瘤细胞与溶酶体染料荧光完美重叠，清晰观察到共定位的溶酶体，MS-CDs主要通过微管蛋白/细胞膜穴样凹陷介导的内吞途径进入细胞。基于其优异的光学性质，实现了斑马鱼活体成像。 2）基于C-N键共价结合及静电吸附，构建了MS-CDs-DOX载药体系。其药物负载率高达90.62%，负载量为45.31mg/g。在pH5.0下，药物的累计释放量最高，72h内达到79.22%，为pH7.4的5.08倍，表明其具有pH响应性。载药体系的肿瘤细胞存活率为78%，低于对照组（单纯DOX组，84%），正常细胞胞存活率为95%，表明该载药体系具有高药物负载率及低毒副作用。MS-CDs-DOX载药体系靶向递送DOX于细胞质中，较少分布于细胞核内，细胞形态边界模糊。因此，氮掺杂的MS-CDs-DOX载药体系更有利于肿瘤示踪和靶向治疗。 3）基于MS-CDs的强石墨化和含氧官能团的强还原性，制备低毒性、绿色荧光MS-CDs/AuNPs。该纳米颗粒平均粒径为28.56nm，紫外特征吸收峰为548nm，表面富含氨基、羟基等含氧官能团，CCK8实验结果显示，此纳米粒具有低细胞毒性，存活率近100%。相较于MS-CDs，MS-CDs/AuNPs的荧光寿命提高了3.8ns，量子产率增加了4.1%，同时具有较大的Stokes位移，抗干扰能力强，在肿瘤细胞中分布于整个细胞内，而正常细胞分布与细胞质中，故可用于识别正常细胞和肿瘤细胞。
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