摘要
食源性生物活性多肽因其来源广泛、制备工艺简单、易消化吸收以及活性多样等特点，逐渐成为健康功能因子开发的研究热点。糖尿病是仅次于肿瘤和心血管疾病的第三大慢性非传染性疾病，糖尿病会导致很多并发症，严重影响患者的生活质量。目前，对于具有降血糖作用的生物活性多肽或酶解产物的相关研究较少，降血糖肽的体外活性评价及其作用机理仍不完善。本论文着重于从海洋资源海参中，定向制备具有改善胰岛素抵抗和降血糖作用的生物活性肽，用T2DM动物模型深入研究海参肽降血糖活性及其分子机制研究，进而对活性肽进行鉴定和合成，并研究合成的活性肽对HepG2细胞胰岛素抵抗以及对MES13细胞炎症和氧化应激的改善作用及其作用机制。本论文的主要研究内容及结果如下所述： （1）探究了木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶和风味蛋白酶这6种蛋白酶对海参酶解产物的蛋白回收率、水解度、抗氧化活性及HepG2-IR细胞葡萄糖摄取量的影响，结果发现木瓜蛋白酶酶解产物具有最强的抗氧化活性和改善胰岛素抵抗活性。木瓜蛋白酶与其它五种蛋白酶进行1:1双酶复配后，木瓜与复合蛋白酶复配的酶解产物的HepG2-IR细胞葡萄糖摄取量最高，具有最强的改善胰岛素抵抗作用，在上述加酶方式的基础上，对加酶量和酶解时间进行进一步探究，筛选得出海参的酶解制备工艺为：木瓜蛋白酶与复合蛋白酶1∶1进行复配，总加酶量为1％，酶解时间为4h，酶解温度55℃，pH7。 （2）通过STZ联合高脂饮食诱导的T2DM大鼠模型，研究了海参酶解物（Seacucumberhydrolysates,SCH）的降血糖作用。结果表明，SCH能改善糖尿病大鼠的体重、饮水量、血脂代谢、肝功能和肾功能。而且，与模型组相比，SCH组的空腹血糖和糖化血红蛋白分别降低了40.39％和33.96％。此外，采用UPLC-qTOF-MS/MS对SCH进行鉴定得到242条肽。SCH的降血糖和降血脂作用可能由于其含有大量的疏水氨基酸和脂肪族氨基酸肽。通过Peptideranker评分和峰强度筛选得到30条具有潜在生物活性的肽。 （3）为了探究SCH在STZ联合高脂饮食诱导的T2DM大鼠中降血糖的作用机制，我们测定了大鼠体内血脂代谢、血清胰岛素以及胰岛素依赖信号通路相关蛋白的表达。结果表明，SCH能够改善T2DM大鼠血糖水平、血脂代谢和胰岛素抵抗，潜在的分子机制研究表明，SCH激活PI3K/Akt信号通路，进一步调节GLUTs和GSK-3β蛋白的表达，从而促进糖原合成，提高胰岛素敏感性。通过对242个鉴定肽的进一步分析，认为SCH的抗糖尿病作用与低分子量的肽有关，这些肽含有丰富的疏水性氨基酸、脂肪族氨基酸和一些具有潜在的胰岛素增敏作用的特异性氨基酸，例如Pro、Phe、Leu/Ile和Ala。 （4）为了鉴定SCH中具有改善胰岛素抵抗作用的活性肽，采用高糖和软脂酸（PA）联合诱导HepG2细胞胰岛素抵抗模型（IR-HepG2），评价海参肽对HepG2细胞的促进葡萄糖摄取和改善胰岛素抵抗作用，并阐明其保护作用机制及相关信号通路。结果表明，SPA能够促进IR-HepG2细胞葡萄糖摄取，分子机制表明SPA提高了IR-HepG2细胞中GLUT2、p-GSK-3β、GS、IRS1、PI3K和p-Akt的表达，并且降低GSK-3β、p-GS和p-IRS1表达。综上所述，SPA可以通过激活PI3K/Akt胰岛素依赖性通路，减轻胰岛素抵抗，促进葡萄糖转运及糖原合成，从而改善IR-HepG2细胞的糖代谢。 （5）为了评价SCH对糖尿病肾病并发症（Diabeticnephropathy,DN）的影响，我们对T2DM大鼠肾脏组织进行了研究，旨在探讨SCH对STZ诱导的糖尿病大鼠的肾脏保护作用，并进一步探讨其作用机制。结果表明，SCH能显著减轻小鼠尿微量白蛋白，且SCH可通过提高SOD和GSH-px的活性和降低MDA的累积来减轻氧化应激。此外，SCH可降低IL-1β、TGF-β和TNF-α等炎症因子的水平。组织学观察还表明，SCH治疗可显著改善肾脏损伤，保护肾脏免受高血糖介导的氧化和炎症损伤。潜在的分子机制研究表明，SCH通过触发Akt/Nrf2信号通路和抑制TLR4/NF-κB信号通路改善肾脏的氧化应激和炎症水平，对糖尿病大鼠的肾病具有一定的保护作用。 （6）为了探究海参肽的肾脏保护作用及相关机制通路，采用高糖诱导的MES13细胞损伤模型评价海参肽对小鼠肾小球系膜细胞的抗炎和抗氧化作用，并利用分子对接技术探讨了Nrf2和NF-κB通路下海参肽的抗氧化和抗炎作用机制。结果表明，WWGP和APGY的抗氧化作用与疏水性（Tyr、Pro和Ala）和芳香性氨基酸（Tyr、Trp和Phe）有关，潜在分子机制表明WWGP和APGY可能通过促进Nrf2的核转位减轻了一系列氧化应激反应。分子对接结果表明，WWGP和APGY可能直接与Keap1结合，干扰Keap1-Nrf2相互作用，从而调节Akt/Nrf2途径。另一方面，ALGP和WWGP的抗炎作用可能与其疏水性（Pro、Ala和Trp）、芳香性氨基酸（Tyr、Trp和Phe）和具有抗炎作用的特异性氨基酸如甘氨酸（Gly）等有关。潜在分子机制表明ALGP和WWGP通过阻止NF-κB的核移位减轻了一系列炎症反应。分子对接结果表明，ALGP和WWGP可能直接与TLR4结合，干扰IκBα-NF-κB的相互作用，抑制NF-κB的积累和核转位，从而调节TLR4/NF-κB信号通路。
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