摘要
目的： 肥胖目前已成为一个重要的社会公共健康问题，且肥胖引起的并发症也成为了临床治疗的难题。肥胖的形成主要包含两个方面，脂肪细胞体积的增大和数目的增多，成脂分化是决定脂肪细胞大小和数目的关键因素。成脂分化过程是在转录因子调控下的级联反应过程，我们通常也可以说甘油三酯在脂肪细胞沉积的过程就是成脂。组蛋白的乙酰化是通过组蛋白乙酰化转移酶将乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）提供的乙酰基转移至组蛋白赖氨酸残基所发生的修饰。目前研究较多的经典组蛋白乙酰化转移酶主要有p300/CBP家族。主流的研究表明组蛋白乙酰化修饰促进成脂，抑制组蛋白乙酰化修饰就抑制了成脂。组蛋白包括五个组分：H1、H2A、H2B、H3、H4，本研究主要探索组蛋白H3赖氨酸残基的乙酰化修饰对成脂分化、HFD(High-fatdiet)小鼠肥胖的影响及作用机制。 方法： 1.成脂分化过程诱导了组蛋白H3乙酰化 （1）培养3T3-L1（永生化小鼠胚胎成纤维细胞）、C3H10T1/2（小鼠胚胎成纤维细胞）构建成脂分化的细胞模型，通过成脂诱导长时间点实验，利用WesternBlot观察在成脂分化过程中组蛋白H3乙酰化的表达水平。 （2）3T3-L1细胞成脂诱导24小时，通过细胞免疫荧光确定成脂分化对H3K27ac（组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化）表达水平的影响。 （3）利用CHIP数据再分析技术分析在成脂分化过程中H3K27ac在成脂相关基因Adipoq、CD36、CFD、DGAT1、MGLL等与转录因子CEBPα、PPARγ等的基因区富集情况。 2.体外抑制组蛋白H3乙酰化即抑制了成脂分化,及组蛋白H3乙酰化调控成脂分化的机制研究 （1）采用组蛋白乙酰化转移酶（p300）的小分子抑制剂A485、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的小分子抑制剂Merck60分别构建组蛋白H3乙酰化下调、上调的细胞模型。3T3-L1细胞分组如下：对照组(NT)、成脂诱导组（M2）、M2+A485、M2+A485+Merck60，分别通过WesternBlot、油红O等技术观察抑制组蛋白H3乙酰化及恢复组蛋白H3乙酰化对成脂相关蛋白的表达水平、成脂分化水平的影响。证明组蛋白H3乙酰化在成脂分化过程中的作用。 （2）随后利用组蛋白乙酰化转移酶的天然分子抑制剂姜黄素（Curcumin）代替A485，重复A485的实验，进一步证明组蛋白H3乙酰化在成脂分化过程中的作用。 （3）同时建立组蛋白H3乙酰化调控成脂分化的表达谱及建立成脂分化过程中组蛋白H3乙酰化（H3K27ac）修饰图谱。3T3-L1细胞分三组：NT、M2、M2+A485处理。分别在指定时间点收RNA，测序，对比表达谱，研究组蛋白H3乙酰化调控成脂分化的分子机制。 （4）最后使用qPCR验证RNA测序结果，明确组蛋白H3乙酰化调控成脂分化的分子机制。 3.体内抑制组蛋白H3乙酰化即减轻了HFD小鼠肥胖 6-8周C57BL/6小鼠60%高脂饲料喂养（HFD）构建小鼠食物性肥胖的模型,并通过腹腔注射A485(25mg/kg.d)或者饲料中混2%姜黄素（Curcumin）,观察小鼠的体重变化。4W后收腹腔白色脂肪组织（eWAT）、皮下白色脂肪组织（iWAT）、棕色脂肪组织（BAT）、肝脏（Liver）,WesternBlot检测各组织H3K27ac表达水平及成脂相关蛋白的表达水平，qPCR检测各组织成脂相关基因的表达水平。在体内明确组蛋白H3乙酰化对HFD小鼠肥胖的影响。 结果： 1.成脂分化过程诱导了组蛋白H3乙酰化 （1）WesternBlot结果显示在3T3-L1细胞及C3H10T1/2细胞中成脂分化过程诱导了组蛋白H3不同位点赖氨酸残基的乙酰化(H3K9ac、H3K14ac、H3K18ac、H3K27ac、H3K56ac)，且乙酰化水平随时间梯度呈上调趋势。 （2）细胞免疫荧光结果证明在成脂诱导24小时时H3K27ac明显被诱导。 （3）CHIP数据再分析得出在成脂分化过程中H3K27ac在成脂相关基因（Adipoq、CD36、CFD、DGAT1、MGLL等）与转录因子（CEBPα、PPARγ等）的基因区富集。 2.体外抑制组蛋白H3乙酰化即抑制了成脂分化，及组蛋白乙酰化通过调控与成脂分化相关的转录因子、基因、蛋白的表达，进而参与成脂分化过程。 （1）WesternBlot、油红O结果证明A485抑制了成脂相关蛋白的表达与成脂分化，Merck60逆转了成脂相关蛋白的表达与成脂分化。明确了体外抑制组蛋白H3乙酰化就抑制了成脂分化。 （2）WesternBlot、油红O结果证明Curcumin抑制了成脂分化，Merck60逆转了成脂分化。进一步明确了体外抑制组蛋白H3乙酰化就抑制了成脂分化。 （3）RNA测序结果证明A485抑制了与成脂分化最相关的PPARγ信号通路及成脂相关基因的表达。证明了组蛋白H3乙酰化通过调控与成脂分化相关的转录因子、基因、蛋白的表达，进而参与成脂分化过程。 （4）qPCR结果验证了RNA测序结果：A485抑制了成脂相关转录因子与基因的表达，Merck60逆转了成脂相关转录因子与基因的表达。进一步证明了组蛋白H3乙酰化通过调控与成脂分化相关的转录因子、基因、蛋白的表达，进而参与成脂分化过程。 3.体内抑制组蛋白H3乙酰化即减轻了HFD小鼠肥胖 （1）与HFD组相比，HFD+A485组小鼠的体重减轻，且eWAT、BAT等组织的H3K27ac表达水平明显被抑制，及成脂相关转录因子、基因、蛋白的表达明显下调。 （2）与HFD组相比，HFD+Curcumin组小鼠的体重减轻、糖耐量改善，eWAT、BAT、Liver等组织的H3K27ac表达水平明显被抑制，且成脂相关蛋白的表达也明显下调。 结论： 成脂分化过程诱导了组蛋白H3不同位点赖氨酸残基的乙酰化，抑制组蛋白H3乙酰化就抑制了成脂分化，且减轻了HFD小鼠肥胖。组蛋白H3乙酰化通过调控与成脂分化相关的转录因子、基因、蛋白的表达，进而参与细胞成脂分化及HFD小鼠肥胖的过程。
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