摘要
研究背景及目的: 原发性肝癌与癌症相关死亡密切相关，每年导致全球70万人死亡。肝细胞癌(HCC)是肝癌的主要病理类型，占病例的90%以上。近年来手术、介入、化疗、靶向治疗及免疫治疗发展迅速，但肝癌个体治疗的疗效差异较大，肿瘤异质性的分子机制仍需要进一步探索。肿瘤微环境在肝细胞癌的发生发展过程中具有重要的促进作用，既往研究证实肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）可通过分泌细胞因子（cytokines）作用于肿瘤细胞促进肿瘤发生发展以及治疗耐受。但外分泌因子调控肿瘤生长和耐药的分子机制还不完全清楚。因此，深入研究肝癌与肿瘤微环境的相互作用的机制，将有助于明确肿瘤发生发展及耐药的不同机制，从而制定有效治疗肿瘤的新策略。 有研究证实部分趋化因子及其受体介导肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的相互作用。在肝细胞癌中，多种趋化因子及其受体通过调节炎症反应、免疫细胞、血管形成以及肿瘤增殖相关通路促进肝细胞癌的发生发展。虽然趋化因子有促进肿瘤发生发展的作用，但趋化因子与肿瘤中异常活化信号通路的关系和信号传导机制仍不完全清楚。ABC转运蛋白参与和介导了包括肺癌、乳腺癌和白血病等多种肿瘤细胞的多药耐药。化疗耐药被认为是肝癌化疗失败的最常见原因,研究表明也与ABC转运蛋白密切相关。然而，ABC转运蛋白在肝癌化疗耐药中的活化机制尚未阐明。本研究从生物信息学、分子、细胞生物学、动物水平以及临床队列等多方面进行探索和验证，试图阐明CCL2/CXCL12通过调控Gli2表达调控ABCC5/ABCC10的分子机制，并证明CCL2/CXCL12-Gli2-ABCC5/ABCC10信号轴在肝癌化疗耐药并促进肝癌生长过程中的重要地位。本研究的开展有助于阐明肝癌进展和耐药的分子机制，为发现新的肝癌治疗靶点提供理论依据。 方法： 1.生物信息学分析、CCK8、流式细胞术、荧光定量PCR(qPCR)和蛋白印迹法（Westernbot）初探CAFs是否参与肝癌细胞对奥沙利铂的耐药； 2.TCGA预测分析、蛋白免疫斑点实验、CCK8耐药实验、qPCR和Westernbot探讨CAFs调控HCC中ABC基因介导耐药的机制； 3.生物信息学分析、qPCR和Westernbot进一步探讨趋化因子CCL2/CXCL12非经典激活Hedgehog信号通路的机制； 4.转录结合位点预测分析、ChIP-PCR和Dua-Luciferase探索Gli2对ABCC5/ABCC10表达的调控； 5.体内共培养移植瘤模型验证CAFs通过CCL2/CXCL12活化Gli2-ABCC5/ABCC10信号轴体内表达模式； 6.临床队列验证奥沙利铂耐药或敏感组间CCL2/CXCL12-Gli2-ABCC5/ABCC10表达水平及CAFs在肿瘤中的富集的关系。 结果： 1.CAFs能显著增强肝癌细胞HepG2和Huh7对奥沙利铂的耐药，且肿瘤细胞中心耐药相关蛋白ABCC5/ABCC10的表达显著升高。 2.CAFs通过分泌CCL2和CXCL12促进肿瘤细胞中ABCC5和ABCC10的表达。 3.CCL2/CXCL12通过活化非经典Hedgehog-Gli2信号通路调控ABCC5/ABCC10的在肿瘤细胞中的表达。 4.Gli2直接调控转录ABCC5和ABCC10的表达。 5.体内研究证实在CAFs富集肿瘤中存在CCL2/CXCL12-Gli2-ABCC5/ABCC10信号轴的活化。 6.与奥沙利铂敏感组相比，CAFs在耐药组的肿瘤间质中显著富集，且组织中CCL2、CXCL12、Gli2、ABCC5和ABCC10基因显著高表达。 结论： 肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）通过分泌CCL2/CXCL12激活Gli2-ABCC5/ABCC10信号通路促进肝癌细胞对奥沙利铂的耐药。
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