摘要
背景与目的： 三丁基锡（tributyltin,TBT）是一种有毒的有机锡化合物，因具有杀菌作用，广泛应用于船体涂料以防止软体生物的吸附，同时其对海洋水生生物及水体造成污染。食用了被TBT污染的海鲜是人体暴露TBT的主要途径。现有研究显示，TBT在人的血液、肝脏、胎盘中均被检测到。TBT具有肝毒性、神经毒性、免疫毒性、生殖毒性等多种毒性效应，其中生殖毒性一直引起人们广泛关注。在雄性动物中，TBT降低睾丸和附睾的重量，影响精子数量和质量。在雌性动物中，TBT降低卵巢和子宫的重量，损害卵泡发育和储备，抑制子宫腺体发育，干扰卵母细胞的成熟。TBT还能阻止胚胎着床，并降低妊娠率、胎儿体重和后代存活率。另外，TBT可通过胎盘屏障，对胎儿产生毒性作用。除直接损害性腺器官外，TBT可改变类固醇激素合成酶的活性，干扰两性的激素稳态。TBT致毒机制中多涉及氧化损伤和凋亡。正常的胎盘和卵巢黄体功能对胚胎着床和妊娠维持具有十分重要的作用，但在TBT生殖毒性的研究中，尚未见其对胎盘生长发育和黄体功能影响的研究。故本研究旨在探讨TBT暴露对妊娠小鼠胎盘生长发育和卵巢黄体功能的影响及其作用机制，为探明TBT可能通过胎盘和黄体功能不全影响胚胎发育的理论提供基础理论支撑。 方法： 1）建立动物模型：小鼠从妊娠第1天（gestationalday1，GD1）开始持续8或13天灌胃不同浓度的TBT（0、0.2和2mg/kg/day）后，处死，收集子宫、胎盘、卵巢、肝、肾等脏器标本，称重、拍照，计算胚胎植入数、流产数；并取血清，放射免疫法检测血清孕酮（Progesterone，P）和雌二醇(Estradiol，E2)的含量。 2）HE染色：观察小鼠GD8外胎盘锥和GD13胎盘的组织形态，统计分析GD13胎盘总面积、滋养层面积、海绵层面积；观察小鼠卵巢黄体的组织结构，统计分析卵巢黄体数目和相对面积。 3）实时荧光定量PCR：检测胎盘关键发育基因Fra1、Eomes、Hand1和Ascl2的mRNA的表达；检测卵巢类固醇激素合成酶基因STAR、HSD3B1、CYP11A1和CYP19A1的mRNA的表达。 4）免疫组化：检测胎盘迷路层胎儿血管laminin、增殖细胞核抗原（ProliferatingCellNuclearAntigen，PCNA）的表达情况；检测卵巢黄体雌激素受体（estrogenreceptor1，ESR1）和细胞色素P450芳香化酶(P450Aromatase，P450arom)的免疫反应性。 5）TUNEL(TdT-mediateddUTPNick-EndLabeling，TUNEL)染色：检测胎盘和卵巢黄体细胞的凋亡数量。 6）免疫印迹：检测胎盘凋亡相关蛋白p53、Bcl-2、cleaved-caspase-3的表达；检测卵巢凋亡相关蛋白p53、Bcl-2、Bax的表达。 7）氧化应激指标检测：检测胎盘和卵巢组织氧化应激参数过氧化氢(HydrogenPeroxide,H2O2)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的水平和抗氧化应激参数超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)的活性。 结果： 第一部分小鼠妊娠期TBT暴露对胎盘生长发育的影响及其作用机制 1）在GD8和GD13，各组间小鼠的妊娠期体重绝对增值和相对增值及肝、肾脏器重量和系数均无明显差异（P＞0.05）。 2）在GD8和GD13，各组间的胚胎着床数无明显差异（P＞0.05）。在GD8，各组均未见明显的胚胎吸收现象；与对照组相比，在GD13，0.2mg/kg/day浓度TBT处理组的胚胎流产数无明显差异（P＞0.05），2mg/kg/day浓度TBT处理组的胚胎流产数明显增加（P＜0.05）。此外，与对照组相比，TBT处理组胎儿重量和系数均显著降低（P＜0.01或0.001）。 3）与对照组相比，在GD13，0.2mg/kg/day浓度TBT处理组的胎盘重量无明显差异（P＞0.05），2mg/kg/day浓度TBT处理组的胎盘重量明显下降（P＜0.05）。此外，与对照组相比，TBT处理组的胎盘系数均显著下降（P＜0.01或0.001）。 4）在GD8，TBT处理组外胎盘锥均明显萎缩。与对照组相比，在GD13，0.2mg/kg/day浓度TBT处理组的胎盘总面积、海绵层面积和迷路层面积均无明显差异（P＞0.05），2mg/kg/day浓度TBT处理组的胎盘总面积、海绵层面积和迷路层面积均明显降低（P＜0.05或0.001）；此外，0.2mg/kg/day的TBT处理组的海绵层/迷宫层面积的比值无明显差异（P＞0.05），2mg/kg/day的TBT处理组的海绵层/迷宫层面积的比值明显上调（P＜0.001）。 5）在GD13，对照组胎盘迷路层内的胎儿血管分支丰富，TBT处理组胎盘迷路层内的胎儿血管分支减少，并血管短缩，尤其2mg/kg/day浓度TBT处理组的胎儿血管网未能形成。统计分析结果显示，与对照组相比，TBT处理组胎盘迷路层内Laminin阳性表达区域均显著下降（P＜0.001）。 6）与对照组相比，在GD8，0.2mg/kg/day浓度TBT处理组的基因Fra1的mRNA的表达水平无明显差异（P＞0.05）、2mg/kg/day浓度TBT处理组的基因Fra1的mRNA的表达水平显著下调（P＜0.001），在GD13，TBT处理组的基因Fra1的mRNA的表达水平均显著下调（P＜0.001），Eomes基因表现出同样的趋势；在GD8，TBT处理组的基因Hand1的mRNA的表达水平均显著下调（P＜0.01或0.001），在GD13，0.2mg/kg/day浓度TBT处理组的基因Hand1的mRNA的表达水平无明显差异（P＞0.05）、2mg/kg/day浓度TBT处理组的基因Hand1的mRNA的表达水平明显下调（P＜0.01）；在GD8和GD13，2mg/kg/day浓度TBT处理组Ascl2的mRNA水平显著下调（P＜0.001），但在GD8，0.2mg/kg/day浓度TBT处理组Ascl2的mRNA的表达水平显著升高（P＜0.01），在GD13，0.2mg/kg/day浓度TBT处理组Ascl2mRNA的表达水平未见明显变化（P＞0.05）。 7）与对照组相比，在GD8和GD13，TBT处理组的胎盘细胞的PCNA阳性细胞的数量均显著减少（P＜0.01或0.001）。 8）与对照组相比，在GD8，0.2mg/kg/day浓度TBT处理组p53蛋白表达未见明显差异（P＞0.05）、2mg/kg/day浓度TBT处理组p53蛋白表达显著上调(P＜0.01)，在GD13,TBT处理组的p53蛋白表达均明显上调(P＜0.05或0.001)；在GD8和GD13，TBT处理组的Bcl-2蛋白均表达下调(P＜0.05或0.001)；在GD8，0.2mg/kg/day浓度TBT处理组cleavdcaspase-3蛋白表达未见明显差异（P＞0.05）、2mg/kg/day浓度TBT处理组cleavdcaspase-3蛋白表达明显上调(P＜0.001)，在GD13，TBT处理组cleavdcaspase-3蛋白表达均明显上调(P＜0.01或0.001)。 9）与对照组比较，在GD8，0.2mg/kg/day浓度TBT处理组的MDA水平、SOD活性无明显差异（P＞0.05），2mg/kg/day浓度TBT处理组的MDA水平明显增加、SOD活性显著降低（P＜0.05或0.001），各组间的H2O2水平和CAT活性没有显著差异（P＞0.05）；在GD13，TBT处理组的MDA水平明显增加（P＜0.001），0.2mg/kg/day浓度TBT处理组的H2O2水平无明显变化（P＞0.05）、2mg/kg/day浓度TBT处理组的H2O2水平明显增加（P＜0.001），0.2mg/kg/day浓度TBT处理组的CAT和SOD的活性无明显变化（P＞0.05）、2mg/kg/day浓度TBT处理组的CAT和SOD的活性显著降低（P＜0.05或0.001）。 第二部分小鼠妊娠期TBT暴露对卵巢黄体功能的影响及其作用机制 10）在GD8，各组间血清孕酮和雌二醇的水平无明显差异（P＞0.05）；在GD13，与对照组相比，0.2mg/kg/day浓度TBT处理组的血清孕酮和雌二醇的水平无明显差异（P＞0.05），2mg/kg/day浓度TBT处理组的血清孕酮和雌二醇的水平显著下降（P＜0.01或0.001）。 11）在GD8，各组间卵巢重量和系数无明显差异（P＞0.05）；在GD13，与对照组相比，TBT处理组卵巢重量和系数均明显下降（P＜0.05或0.01或0.001）。此外，在GD8，各组间的卵巢黄体数目和黄体相对面积无明显差异（P＞0.05）；在GD13，与对照组相比，0.2mg/kg/day浓度TBT处理组的卵巢黄体数目和黄体相对面积无明显差异（P＞0.05），2mg/kg/day浓度TBT处理组的卵巢黄体数目和黄体相对面积明显下降（P＜0.05）。 12）与对照组相比，在GD8和GD13，TBT处理组的STAR、HSD3B1和CYP19A1的mRNA的表达水平均显著下降（P＜0.001）；在GD8，0.2mg/kg/day浓度TBT处理组CYP11A1的mRNA的表达水平无明显差异（P＞0.05），2mg/kg/day浓度TBT处理组CYP11A1的mRNA的表达水平明显下调（P＜0.001），在GD13，TBT处理组CYP11A1的mRNA的表达水平均显著下调（P＜0.001）。 13）在GD8，各组间的ESR1平均光密度值无统计学差异（P＞0.05）。与对照组相比，在GD13，0.2mg/kg/day浓度TBT浓度处理组ESR1平均光密度值无明显差异（P＞0.05），2mg/kg/day浓度TBT浓度处理组ESR1平均光密度值明显下降（P＜0.01）。与对照组相比，在GD8，0.2mg/kg/day浓度TBT处理组Aromatase平均光密度值无明显差异（P＞0.05），2mg/kg/day浓度TBT处理组Aromatase平均光密度值明显下降（P＜0.01）；在GD13，TBT处理组Aromatase平均光密度值均明显下降（P＜0.05或0.01）。 14）与对照组比较，在GD8，TBT处理组卵巢组织的MDA的水平明显增加（P＜0.05或0.01），各组间的H2O2水平和CAT活性无明显差异，0.2mg/kg/day浓度TBT处理组SOD的活性无明显变化（P＞0.05），2mg/kg/day浓度TBT处理组SOD的活性明显降低（P＜0.01）；在GD13，TBT处理组卵巢组织的MDA和H2O2水平均明显增加（P＜0.05或＜0.01），并CAT和SOD活性均明显降低（P＜0.05或0.01或0.001）。 15）在GD8，各组间卵巢黄体的TUNEL阳性细胞数无明显差异；与对照组相比，在GD13，TBT处理组卵巢黄体的TUNEL阳性细胞数均明显增加（P＜0.01或0.001）。 16）免疫印迹结果显示，与对照组相比，在GD8和GD13，TBT处理组促凋亡蛋白p53表达显著上调(P＜0.01或0.001)；在GD8，0.2mg/kg/day浓度TBT处理组Bcl-2蛋白未见明显差异（P＞0.05）、2mg/kg/day浓度TBT处理组Bcl-2蛋白表达显著下调（P＜0.001)，在GD13，TBT处理组Bcl-2蛋白表达均明显下调(P＜0.05或0.001)；在GD8，0.2mg/kg/day浓度TBT处理组Bax蛋白未见明显差异（P＞0.05）、2mg/kg/day浓度TBT处理组Bax蛋白表达显著上调（P＜0.001)，在GD13，TBT处理组Bax蛋白表达均显著上调(P＜0.001)。 结论： 在妊娠早期，母体暴露于TBT可能通过损伤胎盘的发育和下调卵巢黄体的内分泌功能，从而导致不良妊娠结局，其机制可能涉及胎盘关键发育基因表达异常、增殖下调、凋亡上升和氧化应激失调。另外，通过下调黄体数目和面积、类固醇激素合成关键酶的表达水平以及诱导卵巢氧化应激和凋亡等途径影响黄体内分泌功能。
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