摘要
第1章引言 肺癌不仅是全球最常见的肿瘤之一，也是全世界癌症患者的主要死亡原因，其发病率和死亡率在所有癌症中位居首位。肺腺癌是其中最普遍的亚型，在肺癌中占比最大。对于肺癌的治疗，除了外科手术、放化疗之外，靶向治疗和免疫治疗为肺癌的治疗提供了新的方向。但由于其耐药性、有效率及不良反应等问题，治疗效果仍然不够理想。目前，肺癌患者远期生存率仍然很低，其5年生存率只有4%~17%。因此，研究肺癌，尤其是研究肺腺癌中异常表达的基因对进一步阐明其发生和发展的相关机制，确定预后标志物及治疗相关靶点至关重要。着丝粒蛋白K(centromereproteinK,CENPK)，也称为P33，属于着丝粒蛋白家族中的一员，在维持动粒正常功能中起重要的调节作用，是细胞有丝分裂进程中的必要条件之一。目前有关于CENPK在肿瘤中产生的影响及具体机制的研究报导甚少。少量研究表明，CENPK是一种促癌基因，可以促进肝癌和卵巢癌中癌细胞的增殖和转移。然而，关于CENPK在肺腺癌中的生物学功能及预后价值，鲜有文献报道，因此仍需进一步深入研究探讨。 第2章CENPK在肺腺癌中的表达及其临床相关性的分析 目的：了解CENPK在肺腺癌中的表达水平，探究CENPK的差异表达与肺腺癌患者的各项临床病理参数之间的关系及其临床预后意义。 方法：利用公共数据库，使用生物信息学分析方法，结合免疫组织化学染色、Westernblotting和qRT-PCR，探究并验证CENPK在肺腺癌中的表达水平。其次，根据公共数据库中CENPK的表达数据和肺腺癌患者的临床数据，分别采用Kaplan-Meier、单因素及多因素Cox生存分析进一步探究CENPK的差异表达与肺腺癌患者的各项临床病理参数之间的关系及其临床预后意义。 结果：生物信息学分析及qRT-PCR实验结果显示CENPKmRNA表达水平在肺腺癌中升高，Westernblotting及免疫组织化学染色实验结果表明CENPK蛋白表达水平在肺腺癌细胞系及组织中均升高。并且CENPK的高表达水平与肺腺癌患者淋巴结转移和病理分期呈正相关，有统计学差异(P＜0.05)。此外，CENPK的高表达水平与肺腺癌患者预后不良显著相关(P＜0.05)，且多因素Cox分析表明，CENPK可以作为肺腺癌患者预后不良的独立预测因子。 结论：CENPK在肺腺癌中高表达，其表达水平与肺腺癌患者淋巴结转移和病理分期成正相关，CENPK的高表达水平与肺腺癌患者预后不良有关，且可作为肺腺癌患者预后的独立预测因子。 第3章CENPK对肺腺癌细胞生物学行为的影响及其机制的体外研究 目的：在第2章研究结果的基础上，进一步探究CENPK对肺腺癌细胞生物学功能的影响及可能参与的潜在调节通路。 方法：首先利用siRNA干扰肺腺癌细胞系A549中CENPK的表达，并将siRNA-NC转染至A549细胞系作为阴性对照组。通过CCK-8及细胞克隆形成实验检测A549细胞增殖能力变化，通过细胞划痕实验和transwell迁移实验检测A549细胞迁移能力的变化，通过transwell侵袭实验检测A549细胞侵袭能力的变化，通过Westernblotting探究干扰CENPK的表达后对A549细胞中上皮-间质转化(Epithelial-MesenchymalTransitions,EMT)的影响。最后通过生物信息学分析方法，利用癌症基因组图谱(Thecancergenomeatlas,TCGA)数据库中CENPK在肺腺癌中的表达数据，进行基因集富集分析(GeneSetEnrichmentAnalysis,GSEA)，探究CENPK的高表达在肺腺癌中肯可能参与的潜在调节通路。 结果：干扰CENPK在肺腺癌细胞系A549中的表达后，与对照组相比，A549细胞的增殖及迁移能力明显降低。Westernblotting检测发现：干扰CENPK表达后，上皮标记物(E-cadherin)的蛋白表达水平显着增加，间质标志物(N-cadherin,Vimentin)和转录因子(Snail)的水平明显降低，证明CENPK表达降低可抑制EMT过程。最后，通过GSEA分析结果显示CENPK在肺腺癌中的高表达主要与DNA修复、E2FTARGETS、细胞周期(G2MCHECKPOINT)、MTORC1信号通路及PI3K/AKT/MTOR信号通路密切相关。 结论：干扰CENPK的表达后肺癌细胞系A549的增殖、迁移能力下降，且A549细胞中EMT过程被抑制，CENPK可能参与的潜在调节通路是DNA修复、E2FTARGETS、细胞周期(G2MCHECKPOINT)、MTORC1信号通路及PI3K/AKT/MTOR信号通路。 第4章CENPK对肺腺癌细胞系裸鼠体内成瘤的影响 目的：通过体内实验进一步验证干扰CENPK的表达对肺腺癌细胞的增殖能力的影响。 方法：在获取CENPK基因干扰序列后，进行慢病毒的重组质粒构建、包装及滴度的检测，利用慢病毒转染肺腺癌细胞系A549，使A549细胞系上稳定干扰CENPK的表达，随后进行裸鼠体内成瘤实验：将10只5周龄的Balb/C-nu裸鼠随机分为两组，每组5只，实验组注射si-CENPK的A549稳转株，对照组注射siRNA-NC的A549稳转株，随后观察移植瘤的体积及重量的变化，收集相关数据进行统计学分析。 结果：与对照组相比，CENPK敲减组中的裸鼠皮下移植瘤的平均体积和平均重量均显著降低，且有统计学差异(P＜0.05)。 结论：裸鼠体内成瘤实验进一步证实干扰CENPK的表达可以抑制肺腺癌细胞系A549的增殖能力。
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