摘要
研究背景和目的：作为妇科常见的恶性肿瘤，上皮性卵巢癌具有较高的致死率，对广大妇女的身心健康构成了严重的威胁。研究显示，上皮性卵巢癌总体缓解率在10％-35％之间，且缓解期相对短暂。尽管在治疗上皮性卵巢癌方面，已经取得了显著进展，但大多数晚期疾病患者仍然难以避免地经历了复发，最终由于化疗耐药而导致死亡，其中以铂耐药发生率最高。临床上，人上皮性耐顺铂卵巢癌和晚期卵巢癌的治疗一直是个棘手的问题。此外，上皮性卵巢癌的耐顺铂往往表现出多因素的机制，耐药机制比较复杂，目前尚未被完全了解和认识。因此，现阶段治疗铂耐药/铂难治卵巢癌的主要目的是通过序贯单药化疗来维持生活质量和缓解症状，目前的难题仍需要通过创新疗法的临床试验来实现突破。导师带领的课题组一直以来都在中药领域探索，尝试从中药宝库中挖掘出能辅助治疗和改善这些卵巢癌患者疗效的有效中药或中药复合物，期望可以用于这些晚期或耐药卵巢癌的治疗。因此，寻找安全有效的中药用于耐顺铂卵巢癌的治疗意义重大。本研究将小剂量雷公藤多苷（GTW）作用于人上皮性耐顺铂卵巢癌A2780/DDP细胞株，通过体内体外实验观察小剂量GTW对人上皮性耐药顺铂卵巢癌A2780/DDP细胞的生长、侵袭和迁移的抑制作用，并揭示GTW抑制上皮性耐药卵巢癌的作用机制，为GTW临床应用于辅助治疗晚期或上皮性耐药卵巢癌提供实验数据和体内体外评价模型。 第一部分GTW对人上皮性耐顺铂卵巢癌细胞的作用 目的 尝试从细胞水平评价GTW对肿瘤细胞侵袭迁移能力的影响。 方法 1.A2780/DDP细胞的培养、冻存及计数：将A2780/DDP细胞放置在含有链霉素、10％胎牛血清、青霉素的培养液内进行培养。培养条件：环境温度37℃，5％CO2，90％空气湿度，换液周期为2-3d。当细胞贴壁率达90%左右时，进行细胞消化传代。当细胞形状变为圆形时，加入RPMI-1640培养基，并停止消化。取出上清液，得到细胞沉淀物。按9∶1的比例，分别加入胎牛血清900μl和DMSO100μl制作成细胞冻存液1ml，调节细胞浓度。将调节后的冻存液和细胞沉淀均匀混合后冻存。在细胞沉淀物中加入10%胎牛血清等，打散细胞悬液，调整细胞悬液密度至5×104/ml后进行细胞计数。 2.采用CCK8法检测不同浓度GTW、DDP作用于人上皮性耐顺铂卵巢癌A2780/DDP细胞株的细胞存活率，并计算GTW、DDP作用于A2780/DDP细胞后的IC50测定。 3.采用Transwell迁移、侵袭实验检测不同浓度GTW对A2780/DDP细胞进行干预前后的肿瘤细胞的侵袭、转移能力的变化。分组同前。实验重复3次，取穿膜细胞均值作为反映细胞迁移能力指标。 4.采用单向方差分析或双向方差分析进行统计学处理，并以均值表示±SD。P＜0.05表示有统计学意义差异。 结果 1.查阅文献、进行了大量的预实验，并借鉴我们课题组前期研究采用的实验方案，我们选择如下不同浓度梯度的GTW（50μg/ml、200μg/ml、800μg/ml、1600μg/ml、3200μg/ml）作用于A2780/DDP细胞24h，GTW最低的有效抑制浓度为200μg/ml。随GTW浓度的升高，各实验组的细胞存活率呈进行性降低趋势（P＜0.05），GTW对A2780/DDP细胞生长的抑制作用呈现逐渐增强的趋势，且IC50为882.1ug/ml。说明GTW呈剂量依赖性抑制A2780/DDP细胞增殖的作用。 2.不同浓度DDP（0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL）作用A2780/DDP细胞24h，DDP最低有效抑制浓度为1.25μg/mL（P＜0.05）。随DDP浓度的升高，细胞存活率逐渐下降（P＜0.05）。DDP作用于A2780/DDP细胞上的IC50为1.891μg/mL。表明DDP具有剂量依赖性抑制A2780/DDP细胞增殖的作用。 3.小剂量GTW对A2780/DDP细胞的侵袭和迁移能力的抑制作用随着浓度升高而逐渐增强。浓度为200/800/1600/3200μg/mL时，差异显著，具有统计学意义（p＜0.05）。 结论 GTW对A2780/DDP细胞的增殖、迁移和侵袭具有显著的抑制作用，呈剂量依赖性。 第二部分GTW通过ILK/AKT/GSK3β/Slug信号通路抑制人上皮性卵巢癌耐顺铂作用的研究 目的 探讨GTW是否能够通过抑制ILK/AKT/GSK3β/Slug信号通路来抑制上皮间质转化，从而增强DDP的敏感性，抑制肿瘤细胞侵袭转移及耐顺铂作用。 方法 1将A2780/DDP细胞进行基本分组，分为空白对照组、GTW组、DDP组和GTW+DDP组。分别用siRNA-ILK、siRNA-Slug、AKT抑制剂、GSK3β抑制剂作用于各基本分组后，并通过Transwell实验对细胞的变化（侵袭、迁移）情况进行检测。 2用Westernblot法测定各组细胞ILK/AKT/GSK3β/Slug信号通路相关蛋白E-cadherin、N-cadheriin、ILK、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β、slug的表达情况。 3采用单向方差分析或双向方差分析进行统计学处理，并以均值表示±SD。P＜0.05表示有统计学意义差异。 结果 1.与正常对照组相比，DDP组、GTW组、GTW+DDP组能够有效抑制Slug的表达，并且GTW+DDP组抑制作用明显（P＜0.005）。转染siRNA-Slug后，N-cadherin的表达进一步下调，而E-cadherin表达进一步上调，以GTW+DDP组尤为显著，差异具有统计学意义(P＜0.005)。说明siRNA-Slug协同增强了GTW+DDP组对A2780/DDP细胞的侵袭迁移能力的制作用(P＜0.005)。 2.在siRNA-ILK转染后，A2780/DDP细胞的迁移和侵袭能力减弱。与正常对照组相比，DDP组、GTW组以及GTW+DDP组A2780/DDP细胞的迁移和侵袭受到不同程度的抑制，以GTW+DDP组抑制作用明显（P＜0.005）。与正常对照组相比，未转染前，各组ILK、p-AKT、p-GSK3β和Slug的表达下调。尤其在GTW+DDP组，抑制作用最为显著，差异具有统计学意义(P＜0.005)。转染siRNA-ILK沉默ILK后，ILK、p-AKT、p-GSK3β和Slug的水平下调更为显著，N-cadherin的表达进一步下调，而E-cadherin的表达进一步上调，以GTW+DDP组尤为显著，差异具有统计学意义(P＜0.005)。说明siRNA-ILK协同增强了GTW+DDP组的抑制作用。 3.AKT抑制剂（MK2206）可抑制A2780/DDP细胞的生长，且呈剂量依赖性。AKT抑制剂协同促进了GTW、DDP和GTW+DDP对A2780/DDP细胞迁移和侵袭能力的抑制作用，差异显著，具有统计学意义(P＜0.005)。AKT抑制剂促进了GTW组、DDP组和GTW+DDP组的p-AKT、p-GSK3β、ILK蛋白水平的进一步下调。促进了各组A2780/DDP细胞的E-cadherin水平的上调及N-cadherin水平的进一步下调，差异显著，具有统计学意义(P＜0.005)。 4.GSK3β抑制剂可抑制A2780/DDP细胞的生长，且呈剂量依赖性。GSK3β抑制剂协同促进了GTW、DDP和GTW+DDP对A2780/DDP细胞迁移和侵袭能力的抑制作用，以GTW+DDP组抑制作用最为显著，具有统计学意义(P＜0.005)。GSK3β抑制剂诱导了GTW组、DDP组和GTW+DDP组slug、p-GSK3β水平的上调，但不影响p-AKT、ILK。GSK3β抑制剂协同促进了各组细胞的E-cadherin水平上调、N-cadherin水平下调，差异明显，具有统计学意义(P＜0.05)。 结论 1.GTW可协同DDP抑制人上皮性耐顺铂卵巢癌A2780/DDP细胞增殖、迁移和侵袭，增加A2780/DDP细胞对顺铂的敏感性。 2.GTW通过靶向调控ILK/AKT/GSK3β/Slug信号通路，对耐顺铂卵巢癌A2780/DDP细胞的增殖、迁移、侵袭产生有效抑制。通过靶向调控ILK/AKT/GSK3β/Slug信号通路，EMT相关蛋白E-cadherin的水平上调，N-cadherin、ILK、p-Akt、p-GSK3β和Slug的水平下调，以GTW+DDP组尤为明显，说明GTW可通过ILK/AKT/GSK3β/Slug途径靶向抑制肿瘤细胞的EMT来增强对DDP的敏感性，从而抑制肿瘤细胞的耐顺铂作用。 第三部分GTW抑制人上皮性耐顺铂卵巢癌裸鼠体内成瘤作用的研究 目的 通过构建荷耐顺铂人上皮性卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型，尝试通过体内实验进一步证实GTW可通过抑制ILK/AKT/GSK3β/Slug信号通路，抑制EMT，从而抑制肿瘤细胞EMT相关转移及化疗耐药（DDP-耐药）。 方法 1.取4～6周龄体重15～20g的雌性裸鼠48只，按每组12只，随机分为四组，驯化一周。 2.取人上皮性耐顺铂卵巢癌A2780/DDP常规培养，在裸鼠腹腔建模时候，取0.2ml的细胞悬液进行接种，密度控制在每ml细胞数量为2×107个。接种满96h后，在裸鼠尾静脉处抽血0.2ml，离心后吸出血清，-80℃保存，备用。抽血完毕后，当肿瘤体积达到50mm3时，接受以下处理：（1）对照组：每隔一天取生理盐水0.2ml对裸鼠进行灌胃处理，持续10次。（2）GTW组：1mg/kg/dGTW生理盐水稀释成终体积0.2ml，腹腔注药，持续14次。（3）DDP组：顺铂4mg/kg/d，腹腔注射给药，第1、8天给药，总共用药2天。（4）GTW+DDP组：1mg/kg/dGTW生理盐水稀释成终体积0.2ml，腹腔注药，持续14次。在第1天、第8天，按照4mg/kg/d的剂量腹腔注射DDP，总共用药2天。 3.接种后，每天观察荷瘤裸鼠的活动情况、肤色、精神状态，并在接种的第7天起，对荷瘤裸鼠的体重、腹围进行隔日观察，当荷瘤裸鼠的腹围增大时，认为腹腔转移瘤产生。实验截止到最后一次给药后第二天。每周测量两次肿瘤体积，并称重小鼠。实验第22天时，每组取3只小鼠进行安乐死后解剖，观察腹腔成瘤、成瘤位置，统计肠系膜上肿瘤的数量，取下肠系膜以及上面的腹腔转移瘤进行称重。同时留取移植瘤标本，保持无菌，－80℃保存。其余小鼠用于评估生存曲线。 4.采用ELISA法检测GTW、DDP及两者联用治疗荷瘤裸鼠后，血清肿瘤标志物CA125、HE4水平的变化 5.用WesternBlot检测人上皮性耐顺铂卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤组织中E-cadherin、N-cadheriin、ILK、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β、slug蛋白表达水平的改变 6.采用单向方差分析或双向方差分析进行统计学处理，并以均值表示±SD。P＜0.05表示有统计学意义差异。 结果 1.裸鼠腹腔内成瘤后，各组肿瘤体积及重量均有不同程度改变。各组瘤体积：对照组平均为1916.463±52.491mm3，DDP组平均为1014.021±52.553mm3，GTW组平均为1196.322±51.681mm3，DDP+GTW组平均为680.321±33.652mm3。对照组的肿瘤体积最大，DDP组、GTW组及联合组瘤体积均明显小于对照组，结果具有统计学意义（P＜0.05），其中DDP+GTW组的减小程度最明显。而GTW组和DDP组瘤体积次之（P＜0.05）。各组瘤重：对照组平均重0.8210±0.1260g，DDP组平均重0.4797±0.0054g，GTW组平均重0.5413±0.049g，DDP+GTW组平均重0.2777±0.0046g。对照组的肿瘤重量最大，GTW组、DDP组及联合（DDP+GTW）组瘤重均明显小于对照组（P＜0.05），结果具有统计学意义。其中DDP+GTW组瘤体重量的减小程度最明显。而GTW组和DDP组瘤重次之（P＜0.05）。 2.各组瘤生存期方面，对照组的肿瘤生存期的均值和中位数分别为34.6天、37天，DDP组的肿瘤生存期的均值和中位数分别为41.4天、44天，GTW组的肿瘤生存期的均值和中位数分别为39.8天、40天，联合（DDP+GTW）组的肿瘤生存期的均值和中位数分别为46.6天、49天。DDP+GTW组的生存期最长，生存期最长可以达到50天。 3.采用ELISA法检测各组中的CA125、HE4水平时发现：和对照组进行比较，GTW组、DDP及GTW+DDP组使得荷瘤裸鼠血清肿瘤标志物CA125、HE4水平明显下降，以GTW+DDP组下降明显，差异有统计学意义（p＜0.05）。 4.采用WesternBlot法检测人上皮性耐顺铂卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤组织中E-cadherin、N-cadheriin、ILK、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β、slug蛋白表达水平的改变。结果显示：GTW组和DDP组移植瘤组织中的E-cadherin水平均上调，N-cadherin、ILK、p-AKTp-GSK3β和Slug水平均下调。DDP+GTW对肿瘤组织中上述相关蛋白表达的调控作用更为明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 结论 体内实验再一次证实：GTW可通过抑制ILK/AKT/GSK3β/Slug信号通路，抑制EMT，从而抑制肿瘤细胞EMT相关转移及化疗耐药（DDP-耐药）。
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