摘要
目的： 1.研究耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌发生头孢他啶/阿维巴坦耐药的临床特点、菌株毒力及耐药特征。 2.研究耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌发生头孢他啶/阿维巴坦耐药的耐药机制，并分析其与毒力特征之间的关系。 3.一株不产酶的头孢他啶/阿维巴坦耐药耐碳青霉烯高毒力肺炎克雷伯菌的微生物特征和基因组学分析。 方法： 1.收集于2014年1月-2020年6月期间在南昌大学第一附属医院住院患者各类标本中分离的肺炎克雷伯菌618株，剔除重复菌株及资料缺失株。通过药敏试验结果筛选出头孢他啶/阿维巴坦（CAZ/AVI）耐药的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CR-KP）菌株。收集并分析菌株的临床信息。采用PCR和测序方法检测菌株的耐药基因、荚膜血清型基因和毒力基因；采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）及多位点序列分型（MLST）明确碳青霉烯酶种类及流行特征，分析菌株的亲缘性。 2.通过拉丝试验及毒力基因检测从第一部分菌株中筛选出高毒力肺炎克雷伯菌菌株（CR-hvKP），分析其与CR-KP菌株的毒力及耐药性差异，采用PFGE、MLST分析CR-hvKP菌的亲缘性，并采用Southernblot对毒力基因进行定位；通过生物膜形成试验、血清抗性试验等来反映CR-hvKP的毒力。 3.从第二部分菌株筛选出一株不产酶的CAZ/AVI耐药CR-hvKP菌株S15，对其进行全基因组测序分析。与已完成测序的菌株基因组比较，分析其染色体和毒力质粒基因组学，并通过血清抗性试验反映其毒力。 结果： 1.CAZ/AVI耐药CR-KP菌株大部分来源于重症监护室（ICU）和烧伤科，多数患者合并糖尿病(DM)、高血压病、脑血管意外、肝胆疾病等严重的基础疾病。89.5%的患者有侵袭性操作。大部分碳青霉烯类、氟喹诺酮类、头孢菌素类抗生素均耐药，仅少数对替加环素和氨基糖苷类敏感。碳青霉烯酶基因以携带blaNDM-1基因和blaKPC-2基因为主，但也存在blaKPC-3、blaNDM-5基因的流行。荚膜血清分型以K1、K57、K64及未分型为主，但也存在K2、K14、K20、K25等。ST23型和ST11型为主要流行克隆株。检测到sils、mrkd、sils、terw、rmpA、rmpA2等毒力基因的携带，其中sils携带率最高占71.1%。MIST分型显示38株CR-KP属于ST11、ST23、ST4926、ST86、ST540、ST147、ST138、ST14、ST4065、ST345、ST2217、ST2673和ST526等13个不同序列型，其中ST11和ST23为主要流行的克隆株。38株CAZ/AVI耐药CR-KP菌株的同源性研究PFGE图谱结果显示分为14种基因型，其中K型和G型为主要簇群，分别占26.3%(10/38)和23.7%(9/38)。部分ST23型和ST11型CR-KP存在着高度的同源性。 2.从第一部分中筛选出来的15株CAZ/AVI耐药CR-hvKP菌，13例来自重症监护室，2例来自烧伤科。所有患者均有气管插管、导尿管、中心静脉插管、气管切开、呼吸机等侵袭性操作，其中5例患者进行了气管切开。多重耐药率高，对大部分碳青霉烯类、头孢菌素类均耐药。耐药率和CR-KP无统计学差异。碳青霉烯酶基因以携带blaNDM-1基因为主，其次是blaKPC-2基因，3株携带blaNDM-5基因，1株未检出。β内酰胺酶基因和PMQR基因检测到SHV、TEM-1、CTX-M、DHA-1、qnrB、qnrS、acc（6′）-Ib-cr的存在，其中DHA-1、acc（6′）-Ib-cr和非高毒力CR-KP组相比具有统计学意义，未检测出qnrA的存在。MLST分型结果显示ST23为主，占60%，但也存在ST86、ST11等高毒力ST分型。荚膜血清分型中存在K1（66.7%）、K57（26.7%）、K2（20.0%）、K20（13.3%）4型。此外，CR-HvKP菌株的毒力基因携带率非常高，其中rmpA、rmpA2、iuta、terw基因携带率100%，sils基因携带率93.3%，和CR-KP组有统计学差异。质粒复制子分型以IncF型为主，其中ST23型菌株IncF型质粒携带率为66.7%，显著高于其他型菌株，大部分菌株同时携带多个质粒。生物膜形成试验100%阳性。血清抗性试验均为Grade5级和Grade6级，和非高毒力CR-KP组相比具有统计学意义。质粒复制子分型以IncF型为主。MLST分型显示15株CR-HvKP属于ST11、ST23、和ST86等3个不同序列型，其中ST23为主要流行的克隆株，占菌株的66.7%（10/15），ST86占菌株的20.0%（3/15），ST11占菌株的13.3%（2/15）。15株CAZ/AVI耐药CR-HvKP菌株的同源性研究PFGE图谱结果显示分为5种基因型，主要集中在C簇群（9/15，60.0%），A型和B型各2株，D型和E型各1株。簇群C的9株分离株（KP1、KP2、KP3、KP4、KP5、KP7、29、30、31）全部属于ST23型，存在高度的同源性，表明CR-hvKP菌株在我院存在着克隆传播。死亡率高达60.0%，明显高于CR-KP组（34.2%），P＜0.05。挑取的6株代表性CAZ/AVI耐药CR-hvKP菌株（KP4、29、30、KP5、KP3、31），对其携带毒力基因rmpA2的毒力质粒进行定位分析。S1-PFGE和Southern印迹证实了6个菌株存在大约216.9-244.4kb大小的毒力质粒. 3.从第二部分菌株筛选出一株不产酶的CAZ/AVI耐药CR-hvKP菌株S15，对其进行全基因组测序分析。该菌株引起了肺部感染和肝脓肿，荚膜血清分型为K1和K57，序列分型为ST23，携带rmpA、rmpA2、iuta、terw、mrkd5种毒力基因。血清抗性试验显示高毒力表型。全基因组测序结果表明，S15由一条染色体和两个质粒组成。在染色体和质粒上发现6种耐药基因和13种毒力基因。比较基因组分析表明，菌株S15的基因组与其他9株高毒力菌株有很高的同源性，质粒比较基因组分析发现S15菌株的plasmid1与其它8个毒力质粒的同源性较高。毒力基因预测显示携带clbB、fyuA、iroN、irp2、iucC、iutA、mchF、terC、traT、mrkd、rmpA2、sils、terw等毒力基因。耐药基因预测分析显示S15主要携带外膜孔蛋白基因ompk35、0mpk36、β内酰胺酶基因SHV-190和CTX-M-14、喹诺酮基因、磷霉素基因等，未发现碳青霉烯酶基因的存在。预测到可移动遗传元件17个，其中7个在染色体上，10个在质粒上，包括整合子1个，插入序列13个，转座子3个。 结论： 1.在本次研究中，我们发现我院CAZ/AVI耐药CR-KP菌以NDM和产KPC酶为主，荚膜血清分型分布比较分散，以K1、K57、K64及未分型为主，但也存在K2、K14、K20、K25等荚膜血清型菌株。ST23型和ST11型为CR-KP菌主要流行克隆株。 2.CAZ/AVI耐药CR-hvKP菌主要携带blaNDM-1基因为主，其次是blaKPC-2基因，常伴随多种耐药基因，携带多种毒力基因，以ST23型为主，质粒复制子分型以IncF型为主。耐药机制与CRKP菌株相似，传播能力强，且存在CR-hvKP菌株的局部暴发流行。 3.S15菌株是一株不产碳青霉烯酶的ST23型CAZ/AVI耐药CR-hvKP菌株，表现出高毒力表型，CAZ/AVI耐药机制可能与SHV-190有关。
NETL