摘要
研究背景： 邻苯二甲酸二乙基己酯（Di-2-ethylhexylphthalate，DEHP）因可增强塑料的柔韧性和弹性，而在工业上广泛使用。DEHP主要是通过共价键与塑料结合，在高温环境中很容易从塑料中释放至环境中，因此，DEHP可广泛存在于空气、地下水甚至是土壤中，对人类的健康产生重大的影响。 DEHP可通过血-脑屏障而在脑中积累。DEHP可抑制大脑中胆固醇的合成，并影响脂质代谢和分布，从而影响髓鞘的形成。DEHP可损害中脑中多巴胺神经元并影响多巴胺的合成，由于多巴胺在学习、认知和记忆中起着重要作用，因此DEHP可损害机体的记忆、自理能力以及空间学习能力。海马位于大脑皮层的下面，在记忆的形成和巩固中起着非常重要的作用。海马神经元的树突可受到很多种类化学物质的影响，比如无机砷和有机污染物等。研究显示，海马也可因母婴或者出生后暴露DEHP而受到损害。 在本研究中，我们通过动物模型和小鼠海马神经元HT22细胞来阐述DEHP诱导小鼠海马自噬和凋亡的机制，可为DEHP导致的神经损伤提供新的理论基础和实验依据。 第一部分DEHP诱导小鼠海马组织凋亡和自噬 目的： 通过动物实验探讨DEHP对小鼠海马组织凋亡、自噬和氧化应激的影响，并明确DEHP诱导的小鼠海马组织凋亡和自噬是否与氧化应激密切相关。 方法： 成年小鼠在分别用不同浓度的DEHP（0,100,200,400mg/kg）连续染毒3周后，用HE染色法检测小鼠海马组织的形态；用Westernblot检测凋亡相关蛋白Caspase-8、Caspase-3、Bcl-2和Bax和自噬相关蛋白Atg5、Beclin1和LC3的表达情况。检测小鼠海马组织内MDA和GSH的含量以及抗氧化酶SOD和GSH-PX的活性。 结果： 成年小鼠在分别用不同浓度的DEHP（0,100,200,400mg/kg）连续染毒3周后，用HE染色法检测小鼠海马组织的形态。结果显示，DEHP对小鼠海马组织形态无显著影响。Westernblot结果显示，DEHP可显著增加小鼠海马组织内Bax以及剪切后的Caspase-8和Caspase-3蛋白表达，并显著降低Bcl-2的表达，提示DEHP可诱导小鼠海马组织凋亡。 为了明确DEHP是否可诱导小鼠海马组织自噬，成年小鼠在分别用不同浓度的DEHP（0,100,200,400mg/kg）连续染毒3周后，用Westernblot检测小鼠海马组织内自噬相关蛋白Atg5、Beclin1和LC3的表达情况。结果发现，与对照组相比，DEHP可显著增加小鼠海马组织中自噬相关蛋白Atg5和Beclin1的表达，同时DEHP处理组中的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例也显著增加，提示DEHP可诱导小鼠海马组织自噬。 为了探明DEHP诱导的小鼠海马组织凋亡和自噬的可能机制，成年小鼠在上述浓度的DEHP连续染毒3周后，检测小鼠海马组织内MDA和GSH的含量以及抗氧化酶SOD和GSH-PX的活性。结果显示，DEHP可显著增加小鼠海马组织内MDA含量，而显著降低GSH含量；同时DEHP还可抑制小鼠海马组织内SOD和GSH-PX活性，提示DEHP可诱导小鼠海马组织产生氧化应激。 结论： 1、DEHP对小鼠海马组织形态无显著影响；但可显著增加小鼠海马组织内Bax以及剪切后的Caspase-8和Caspase-3蛋白的表达，抑制Bcl-2蛋白的表达，提示DEHP可诱导小鼠海马组织凋亡； 2、DEHP可显著增加小鼠海马组织中自噬相关蛋白Atg5和Beclin1的表达以及增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例，提示DEHP可诱导小鼠海马组织自噬； 3、DEHP可显著增加小鼠海马组织内MDA含量，而显著降低GSH含量以及SOD和GSH-PX活性，提示DEHP可诱导小鼠海马组织产生氧化应激。 第二部分DEHP通过氧化应激诱导小鼠海马神经元HT22细胞凋亡 目的： 通过体外细胞实验，探讨DEHP是否诱导小鼠海马神经元HT22细胞凋亡及其机制。 方法： 小鼠海马神经元HT22细胞在预先用或者不用氧化应激抑制剂N-乙酰-L半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine，NAC）处理的情况下，再用相应浓度的DEHP处理后，用CCK8试剂盒检测细胞活性；用LDH试剂盒检测细胞内LDH的释放情况；用Westernblot检测凋亡相关蛋白Caspase-8、Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达情况；用Hoechst33342对细胞进行染色以观察细胞核的形态；用AnnexinV-FITC/PI染色法对细胞进行双染色；用氧化应激检测试剂盒检测细胞内MDA和GSH的含量以及抗氧化酶SOD和GSH-PX的活性。 结果： 小鼠海马神经元HT22细胞在分别用不同浓度的DEHP（0、2.5、5、10、20、40和80μM）处理24h后，用CCK8试剂盒检测细胞活性。结果发现，与对照组相比，2.5和5μM的DEHP对小鼠海马神经元HT22细胞活性无显著影响（P＞0.05），而10、20、40和80μM浓度的DEHP则呈浓度依赖式地抑制细胞活性（P＜0.05）。小鼠海马神经元HT22细胞在分别用0、10、20和40μM浓度的DEHP处理细胞24h后，细胞内的LDH释放也显著增加。Westernblot结果显示，DEHP可显著增加剪切后的Caspase-8（cleavedCaspase-8）、Caspase-3（cleavedCaspase-3）和Bax蛋白的表达；同时，DEHP处理组中Bcl-2表达则呈浓度依赖式地下降。Hoechst33342染色结果显示，对照组中固缩的细胞核和凋亡小体非常少；而DEHP处理后细胞核固缩和凋亡小体的数量显著增加，且呈浓度依赖式地增加。DEHP还可显著增加AnnexinV-FITC（+）PI（-）和AnnexinV-FITC（+）PI（+）细胞总数。以上结果提示，DEHP确实可诱导小鼠海马神经元HT22细胞凋亡。为了探索DEHP诱导小鼠海马神经元HT22细胞凋亡的机制，我们在分别用0、10、20和40μM浓度的DEHP处理小鼠海马神经元HT22细胞24h后，检测细胞内MDA和GSH的含量以及抗氧化酶SOD和GSH-PX的活性。结果显示，DEHP可显著增加细胞内MDA含量，而显著降低GSH含量；同时DEHP还抑制SOD和GSH-PX活性，以上结果提示，DEHP可诱导小鼠海马神经元HT22细胞产生氧化应激。 为了明确氧化应激是否参与了DEHP对小鼠海马神经元HT22细胞活性的抑制，细胞在预先用或者不用5mM氧化应激抑制剂N-乙酰-L半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine，NAC）处理，再用0或40μM浓度的DEHP处理细胞24h后，检测细胞活性和细胞内LDH的释放情况。结果显示，与对照组相比，40μM浓度的DEHP处理组细胞活性显著下降，而细胞内LDH的释放则显著增加，提示DEHP对小鼠海马神经元HT22细胞有一定的损伤作用；与DEHP处理组相比，NAC+DEHP处理组中的细胞活性则呈现一定程度的回升，而且细胞内LDH的释放则下降，以上结果提示，DEHP可通过氧化应激抑制小鼠海马神经元HT22细胞活性。与DEHP处理组相比，NAC+DEHP处理组中剪切的cleavedCaspase-8、cleavedCaspase-3以及Bax的蛋白表达量显著降低，但Bcl-2的蛋白表达量则显著增加。同时，AnnexinV-FITC/PI双染色法结果显示，与40μM浓度的DEHP处理组相比，NAC+DEHP处理组中的AnnexinV-FITC阳性细胞数则显著减少。以上结果提示，DEHP确实可通过氧化应激诱导小鼠海马神经元HT22细胞凋亡。结论： 1、DEHP可抑制小鼠海马神经元HT22细胞活性并诱导小鼠海马神经元HT22细胞凋亡； 2、DEHP可诱导小鼠海马神经元HT22细胞产生氧化应激； 3、DEHP可通过氧化应激抑制小鼠海马神经元HT22细胞活性和诱导小鼠海马神经元HT22细胞凋亡。 第三部分自噬在DEHP诱导小鼠海马神经元HT22细胞凋亡中的作用 目的： 探讨DEHP是否诱导小鼠海马神经元HT22细胞自噬以及TRAF4/RPS6KB1信号系统在DEHP诱导的细胞自噬中的作用；并结合自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA），最终明确自噬在DEHP诱导的小鼠海马神经元HT22细胞凋亡中的作用。 方法： 小鼠海马神经元HT22细胞在分别用不同浓度的DEHP处理后，用Westernblot检测细胞内自噬相关蛋白Atg5、Beclin1和LC3的表达情况；用透射电子显微镜观察细胞内自噬泡的情况。用Westernblot检测细胞内TRAF4、RPS6KB1和p-RPS6KB1蛋白表达的情况。为了探讨TRAF4是否可激活小鼠海马神经元HT22细胞内的RPS6KB1，我们分别过表达和敲减小鼠海马神经元HT22细胞内的TRAF4，用Westernblot检测细胞内RPS6KB1和p-RPS6KB1的表达和自噬情况。 结果： 小鼠海马神经元HT22细胞在分别用不同浓度的DEHP（0、10、20和40μM）处理24h后，用Westernblot检测细胞内自噬相关蛋白Atg5、Beclin1和LC3的表达情况。结果发现，DEHP可显著增加小鼠海马神经元HT22细胞中自噬相关蛋白Atg5和Beclin1的表达，而且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例也显著增加，提示DEHP可诱导小鼠海马神经元HT22细胞自噬。透射电子显微镜结果显示，与对照组相比，DEHP处理组中的自噬泡显著增多。以上结果提示，DEHP确实可诱导小鼠海马神经元HT22细胞自噬。 为了探明氧化应激是否参与DEHP诱导的小鼠海马神经元HT22细胞自噬，小鼠海马神经元HT22细胞在预先用或者不用氧化应激抑制剂5mMNAC处理的情况下啊，再用40μM的DEHP处理细胞24h。结果显示，与DEHP处理组相比，NAC+DEHP处理组的细胞自噬相关蛋白Atg5和Beclin1的表达显著下降，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例也显著下降。透射电子显微镜结果显示，与DEHP处理组相比，NAC+DEHP处理组中的自噬泡显著减少。以上结果显示，DEHP可通过氧化应激诱导小鼠海马神经元HT22细胞自噬。 为了进一步深入探讨DEHP诱导小鼠海马神经元HT22细胞自噬的机制，小鼠海马神经元HT22细胞在用不同浓度的DEHP（0,10,20,40μM）处理小鼠海马神经元HT22细胞24h。结果发现，DEHP可显著降低细胞内TRAF4和磷酸化RPS6KB1（p-RPS6KB1）的表达，提示DEHP可抑制小鼠海马神经元HT22细胞TRAF4/RPS6KB1信号通路。同时还发现，TRAF4过表达可显著增加p-RPS6KB1的蛋白含量，而TRAF4敲减则可降低p-RPS6KB1的含量，提示TRAF4可使小鼠海马神经元HT22细胞内的RPS6KB1蛋白激活。TRAF4过表达可降低DEHP处理组的细胞自噬相关蛋白Atg5和Beclin1的表达以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例。以上结果显示，TRAF4可抑制DEHP诱导的小鼠海马神经元HT22细胞自噬。 为了明确DEHP诱导的细胞自噬对小鼠海马神经元HT22细胞活性是起保护作用还是破坏作用。小鼠海马神经元HT22细胞在分别用或者不用自噬抑制剂3-MA（1mM）的情况下，再用DEHP处理细胞24h后，检测细胞活性和细胞内LDH的释放情况。结果显示，与DEHP处理组相比，3-MA+DEHP处理组的细胞活性显著降低，而细胞内LDH的释放则显著增加。Westernblot结果显示，与DEHP处理组相比，3-MA+DEHP处理组中的cleavedCaspase-8、cleavedCaspase-3和Bax的表达量进一步增加，而Bcl-2的表达则降低。同时还发现，3-MA可增加DEHP处理组中的AnnexinV-FITC阳性细胞数，提示自噬抑制可进一步诱导DEHP诱导的小鼠海马神经元HT22细胞凋亡。以上结果提示，自噬在DEHP诱导的小鼠海马神经元HT22细胞凋亡中起保护作用。 结论： 1、DEHP可诱导小鼠海马神经元HT22细胞自噬，氧化应激参与了DEHP诱导的小鼠海马神经元HT22细胞自噬； 2、DEHP可抑制小鼠海马神经元HT22细胞内TRAF4/RPS6KB1信号通路，TRAF4可使小鼠海马神经元HT22细胞内的RPS6KB1蛋白磷酸化，TRAF4可抑制DEHP诱导的小鼠海马神经元HT22细胞自噬； 3、自噬抑制可增强DEHP对细胞活性的抑制并促进DEHP诱导的小鼠海马神经元HT22细胞凋亡，自噬在DEHP诱导的小鼠海马神经元HT22细胞凋亡中起保护作用。
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