摘要
研究目的： 构建EBP50过表达的慢病毒质粒载体，包装成慢病毒后感染CIA-FLS细胞，系统的探讨EBP50基因对CIA-FLS生物学行为的影响：增殖水平、自噬水平、凋亡水平、迁移与侵袭情况以及基质金属蛋白酶的表达情况，并在明确EBP50功能的情况下探讨其影响的相关机制，以期为RA新的治疗靶标的发现提供理论和实验依据。 研究方法： 1.EBP50过表达重组慢病毒表达质粒的构建：采用普通PCR的方法从质粒pLenti-146-EBP50中扩增出EBP50基因，然后克隆入慢病毒框架质粒PLVX-IRES-ZsGreen1中，获取重组慢病毒表达质粒rPLVX-EBP50，并进一步通过限制性内切酶酶切鉴定，鉴定正确后送测序验证。 2.重组慢病毒的包装以及滴度测定：将慢病毒包装质粒pMD2G和psPAX2与目的质粒/框架质粒按一定比例混匀，共转染至支原体处理剂作用过的293T细胞中，于72h收集上清，采用超高速离心的方法进行慢病毒浓缩，最终得到重组慢病毒LV-Plvx和LV-EBP50。将浓缩后的慢病毒LV-Plvx感染CIA-FLS细胞，通过稀释计数法明确病毒滴度。 3.重组慢病毒表达效果鉴定：重组慢病毒以MOI=10感染CIA-FLS细胞，于48h、72h、96h用荧光显微镜观察荧光表达，确定慢病毒表达的最佳时间，并且于最佳表达时间分别采用RT-PCR和Westernblot法检测EBP50在CIA-FLS细胞中的表达。 4.探讨EBP50对CIA-FLS细胞生物学行为的影响以及相关机制：增殖水平、自噬水平、凋亡水平、侵袭与转移情况以及基质金属蛋白酶的表达情况；并在明确EBP50功能的情况下探讨其影响CIA-FLS相关机制的通路蛋白。 研究结果： 1.限制性内切酶酶切和测序结果均显示成功构建了重组慢病毒表达质粒rPLVX-EBP50。 2.成功获取了重组慢病毒LV-Plvx和LV-EBP50，滴度均在1.0×108TU/ml以上，可以用于细胞水平的研究。同时，重组慢病毒感染CIA-FLS细胞96h时荧光表达最强，且细胞状态良好。 3.重组慢病毒感染CIA-FLS细胞后，RT-PCR与Westernblot均能检测到EBP50的表达上调，证实重组慢病毒可成功在CIA-FLS细胞中表达。 4.与对照组比较，LV-EBP50感染组对CIA-FLS细胞增殖水平有显著的抑制作用。 5.与对照组比较，LV-EBP50感染组对CIA-FLS细胞自噬水平并无任何影响。 6.与对照组比较，LV-EBP50感染组对CIA-FLS细胞凋亡水平有显著的促进作用，同时，进一步结果提示通过激活caspase-3以促进细胞凋亡。 7.与对照组比较，LV-EBP50感染组对CIA-FLS细胞侵袭与转移水平有显著的抑制作用，同时，进一步结果提示其机制与下调MMP-9有关。 结论： 本研究成功构建了EBP50重组的慢病毒表达载体，并通过慢病毒包装，获取了可在CIA-FLS中有效表达EBP50的重组慢病毒LV-EBP50。 2.EBP50过表达可显著抑制CIA-FLS的增殖水平而不影响其自噬水平。 3.EBP50过表达可通过激活caspase-3以促进CIA-FLS的凋亡水平。 4.EBP50过表达可通过下调MMP-9以抑制CIA-FLS的侵袭与转移。
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