摘要
人乳头瘤病毒（Humanpapillomavirus，HPV）的持续感染能导致上皮组织的增生性病变和多种良恶性肿瘤。已有超过200种的HPV被鉴定，其中至少25种高危型别与宫颈癌高度相关。在世界范围内，宫颈癌作为女性的第三大恶性肿瘤，每年约有56.9万人被诊断为宫颈癌，死亡病例约31.1万人，严重威胁女性健康。接种HPV疫苗是预防宫颈癌的有效手段，目前已有两价、四价和九价疫苗上市。HPVL1蛋白在体外能自组装形成病毒样颗粒(virus-likeparticle，VLP)，具有较强的免疫原性，是目前HPV疫苗免疫原的主要形式。由于HPVVLP具有严格的型别限制性(type-restricted)，难以诱导产生交叉中和抗体，因此HPV疫苗采用多种VLP混合来预防不同型别的感染。HPV九价疫苗包含7种高危型别能预防约90％的宫颈癌，但是对疫苗组分之外的18种高危型别HPV引发的约10％的宫颈癌及相关病变无法实现有效保护;九价疫苗昂贵的售价也限制了其在欠发达地区广泛接种。为扩大疫苗保护范围只能不断增加VLP种类，导致免疫原剂量过高，从而带来更加高昂的成本、更复杂的生产工艺和潜在的安全性问题，因此设计“以一防多”的HPV交叉疫苗具有十分重要的意义。本实验室前期基于HPVL1蛋白结构保守性，通过同源环区替换构建三型嵌合VLP，能诱导三型交叉中和抗体。尽管该方法能通过一种嵌合VLP产生三种型别的交叉保护，但是若要保护20种以上的高危型HPV，仍然需要至少7种VLP，同时该方法只能在近缘型别间构建嵌合体，无法产生远缘型别的交叉中和抗体。能否通过精准设计，在单一免疫原上实现更多型别的交叉保护，是包括HPV在内的多基因型病原疫苗设计的关键科学问题。近年来随着结构生物学的发展，通过解析抗原抗体免疫复合物结构陆续发现了流感病毒(influenzavirus)、人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus，HIV)等高变病原体靶标蛋白上保守的抗体结合位点，这使得基于交叉中和抗体指导交叉疫苗设计成为可能。但由于目前缺乏高分辨率的HPV与交叉中和抗体免疫复合物结构信息，难以从分子水平上深入理解交叉中和表位的空间结构和抗体功能机制，极大地限制了HPV交叉疫苗的研究。 针对上述科学问题和挑战，本研究从高危型别交叉中和抗体入手，解析高分辨率的病毒与抗体免疫复合物结构，揭示交叉中和表位的空间分布特征，阐明抗体发挥交叉中和作用的分子机制。在野生型VLP上完成交叉中和表位重建，构建多型别交叉免疫原，为设计HPV多型别交叉疫苗奠定理论基础。 首先，本研究首次建立了HPV高危型别交叉中和抗体盘。对前期筛选获得的交叉反应性抗体进行全面的性质鉴定，发现存在两种不同的中和模式:第一种是抗体4H4、6C8、6H4和12B9，既能阻碍病毒吸附细胞外基质也能阻碍吸附细胞膜;第二种是抗体13A10，阻碍病毒吸附细胞外基质但是不阻碍病毒吸附细胞膜，其通过干扰病毒在细胞膜上迁移入胞实现中和作用。13A10是抗体盘中性质最优的抗体，能高效中和HPV16、31、33和58四种高危型别。进一步测定该抗体的亲和力同时制备Fab，比较抗体与Fab的功能差异，发现抗体有更强的交叉中和以及交联结合病毒颗粒的能力。 其次，本研究阐明了HPV抗体跨型中和的分子结构基础。通过WAVE生物反应器和超速离心获取高纯度的均一的HPV假病毒(pseudovirus，PsV)，并制备PsV与交叉中和抗体13A10Fab的免疫复合物。通过冷冻电镜单颗粒重构技术解析HPV16∶13A10、HPV31∶13A10、HPV33∶13A10和HPV58∶13A10四种免疫复合物结构，分辨率分别为4.19(A)、13.76(A)、6.40(A)和4.92(A)。利用局部重构的方法优化HPV16∶13A10和HPV58∶13A10结构，搭建原子模型分析发现每个五聚体结合5个Fab分子。13A10能同时结合来自三个相邻L1蛋白单体的DE环、FG环和HI环。13A10识别HPV16L1蛋白的8个表位氨基酸(S280、G281、N285、S349、E352、K356、T358和N359)，识别HPV58L1蛋白的10个表位氨基酸（Q139、P140、S142、S280、G281、T349、E351、K355、D357和N358）。S、G、E、K、N这5个关键位点在HPV16和58上具有高度的序列保守性和结构保守性，这是13A10产生跨型交叉中和的结构基础。我们也进一步分析了13A10双价结合同一病毒颗粒的潜在模型，解释了抗体中和能力强于Fab的原因。 进一步地，本研究对交叉中和表位关键氨基酸进行系统的功能表征。通过丙氨酸扫描在HPV16、31、33和58四种型别的VLP和PsV上验证了交叉中和表位各位点在抗体识别以及病毒感染中的功能，发现四型L1蛋白上完全保守的表位氨基酸S280、G281、K356、N359既在抗体结合中十分重要，也是病毒感染细胞的关键氨基酸。从分子层面揭示了13A10中和作用机制可能是通过结合HPVL1蛋白上特定的受体互作位点（例如K356），在病毒吸附细胞膜后干扰其与受体的持续相互作用;同时抗体也能稳定HPV衣壳构象，干扰病毒感染所必需的衣壳变构。 最后，本研究首次基于交叉中和表位设计了HPV多型别交叉免疫原。通过交叉中和表位重建，不仅突破了近缘型别间的型别特异性，更在远缘型别间建立跨型交叉免疫原性，使单一型别VLP最少仅变化5个关键位点就能诱导产生显著的多型别交叉中和抗体滴度。我们总结了表位重建设计原则，获得了具有5型交叉免疫原性（HPV31、33、35、52和58）的HPV多型别交叉疫苗候选分子HPV35FG+/HI+VLP。 综上所述，本研究基于结构疫苗学的思路和方法，研究HPV高危型别跨型交叉中和抗体识别表位，从分子水平阐明了抗体抵抗病毒感染的分子机制和结构基础。基于精确的交叉中和表位结构图谱和功能图谱，设计了具备5型交叉免疫保护性的HPVVLP，从而为更加高效的、覆盖范围更广的HPV多型别交叉疫苗研发以及其它多基因型病毒通用疫苗的设计提供理论依据。
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