摘要
伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)属于α疱疹病毒亚科，可引起猪的伪狂犬病(Pseudorabies，PR)，具有传播范围广、死亡率高等特点，对养猪业造成巨大经济损失。PRV可交叉感染牛、羊、猫等各种动物，此外也出现少量人类感染的病例，被感染的患者主要表现为眼内炎、脑炎等症状。虽然PR的兽用减毒活疫苗已经广泛投入使用，但PRV具有神经潜伏特性，一旦发生基因突变会被重新激活感染，容易造成新的疫情。PRV结构复杂，从外向内主要包括四个部分:富含糖蛋白的囊膜，皮层蛋白，二十面体核衣壳和内部的基因组。在PRV成熟过程中有三种类型衣壳:空心的A型衣壳(A-capsid)、内部含有支架蛋白的B型衣壳(B-capsid)以及装载基因组的C型衣壳(C-capsid)。PRV是研究疱疹病毒的模式病毒，同时在神经示踪及溶瘤病毒方面也有巨大应用潜力。深入研究PRV衣壳结构，对防治PR及改造利用病毒具有重大意义。本研究主要采用冷冻电镜技术结合结构生物学的分析手段，解析PRVA-capsid及C-capsid高分辨率结构，探究衣壳蛋白间相互作用机制。 首先，本研究获得了高纯度的PRV病毒样品，冷冻电镜观察发现PRV样品中主要存在A-capsid和C-capsid两种颗粒形式。通过单颗粒三维重构技术，获得A-capsid和C-capsid的正二十面体对称结构，分辨率分别为4.53(A)和4.43(A)。电镜密度图显示，PRV的基因组在C-capsid内部呈现同心圆式的规则排列。PRV两种衣壳结构组成高度相似，但C-capsid表面在五倍轴区域覆盖有衣壳相关皮层蛋白复合物（capsidassociatedtegumentcomplex，CATC）。 由于PRV衣壳直径超过120nm，常规的单颗粒重构会出现局部欠焦值评估不准的现象，限制三维重构的分辨率。为改善这种问题，本研究采用局部重构的方法，将PRV两种衣壳的二、三、五倍轴局部区域信号分别进行提取并进行局部重构，成功将PRV两种衣壳结构的提高到近原子分辨率(＜4(A))。接着，基于高分辨率电镜结构，本研究搭建了PRV两种衣壳的原子模型，并基于原子模型分析衣壳组装机制。PRV衣壳主要由955个主要衣壳蛋白(Majorcapsidprotein，MCP)、900个次要衣壳蛋白(Smallcapsidprotein，SCP)及960个三聚体(Triplex)蛋白等亚基单元组成。MCP组装成五聚体(Penton)和六聚体(Hexon)，并在内部发生广泛的相互作用。覆盖在Hexon顶部的SCP和嵌在Hexon与Penton之间的Triplex进一步稳固整个衣壳。同时本研究在Triplex的下方观察到疑似N端锚定结构，将基因组锚定在整个衣壳上。这些观察加强了本研究对PRV乃至疱疹病毒衣壳结构的认识。 最后，本研究聚焦PRV衣壳特殊的门户(portal)顶点的结构解析。Portal只存在于PRV衣壳十二个五倍轴顶点中的其中一个顶点，portal内部结果为十二倍对称，与整体衣壳之间出现“对称失配”（symmetrymismatch）的现象，使用传统的二十面体重构方法会将portal结构的信号平均掉。本研究利用五倍轴亚颗粒对称性释放及三维分类等方法，成功分离出C-capsid的portal部分的亚颗粒，最终获得6.8(A)分辨率的portal结构，并基于portal的取向构建了含有portal的完整PRVC-capsid结构(6.9(A))。结构显示portal顶点与普通五聚体顶点之间存在着巨大差异。Portal顶点包括下方十二倍对称portal和上方五倍对称的触手状螺旋(tentaclehelices)。同时portal顶点结构保留的尾部DNA密度也证实了portal包装释放基因组的功能，提示portal结构在PRV衣壳组装中不可或缺的作用。 综上，本研究通过冷冻电镜技术及局部重构方法，解析了高分辨率的PRVA-capsid和C-capsid的结构，从分子水平阐述了PRV衣壳各亚基之间的相互作用机制，同时首次解析到PRV衣壳的porta1结构。这些发现为更加全面地认识PRV，理解PRV衣壳组装机制，丰富疱疹病毒家族结构研究提供了重要参考。
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