摘要
外膜囊泡(outermembranevesicles，OMVs)是普遍存在于革兰氏阴性菌中的胞外囊泡，具有物质分泌、营养摄取、氧化应激和防御抵抗等生理功能。新鞘氨醇杆菌US6-1(NovosphingobiumpentaromativoransUS6-1)是少数能够高效降解高分子量多环芳烃的模式菌，在苯并芘(benzo[a]pyrene，BaP)压力下，US6-1细胞可产生数量较多的外膜囊泡。为了探究在BaP压力下US6-1外膜囊泡的产生机制和功能，本研究以BaP压力下新鞘氨醇杆菌US6-1为研究对象，通过透射电子显微摄影、外膜囊泡提取和纯化、蛋白质定性质谱分析以及荧光定量PCR、细胞活性氧检测、转录组测序等技术手段分析US6-1在BaP压力下的细胞形态变化、细胞生理响应、外膜囊泡结构及蛋白组成的变化，以揭示外膜囊泡的产生机制和功能，主要研究结果如下: 1、相比于新鞘氨醇杆菌US6-1在2216E培养条件下产生的结构简单的外膜囊泡，US6-1在BaP压力下产生了数量更多的直径介于200nm-700nm之间的具有多层膜结构的外膜囊泡。透射电镜观察结果显示，BaP压力下产生的外膜囊泡中的多层膜结构同时存在于细胞质，并且外膜囊泡内容物密度接近细胞质。此外，相比2216E培养条件，US6-1在BaP压力下的细胞壁呈现波浪状蜷曲。这些结果暗示US6-1在BaP压力下产生的外膜囊泡可能来源于细胞质而非周质空间; 2、转录组数据分析结果表明，在细胞壁相关的基因中，相比丙酮酸对照组，BaP压力下新鞘氨醇杆菌US6-1中Tol-Pal系统基因的转录水平显著下调，与甘油磷脂合成相关的基因glpA转录上调。能量代谢相关的基因中，在BaP压力下US6-1细胞中调控氧化磷酸化的RegA/RegB信号系统转录水平下调，氧化磷酸化复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ整体转录水平下调，聚β-羟基丁酸酯合成分解的酶基因转录水平下调。此外，在BaP压力下US6-1部分tbdt基因转录水平上升，其中NSU_pLA1112呈现高转录水平。这些结果表明在BaP压力下US6-1细胞壁稳定性下降、能量代谢受阻和TBDT转运系统具有转录活跃; 3、随着培养时间的延长，BaP压力下新鞘氨醇杆菌US6-1细胞中活性氧水平和产生的外膜囊泡数量相比2216E培养条件显著上升。US6-1外膜囊泡蛋白质谱结果显示，BaP压力下US6-1产生的外膜囊泡有着更高比例的细胞质蛋白。其中，在BaP压力下US6-1产生的外膜囊泡中存在DNA修复蛋白和多种与活性氧应激相关的蛋白质，包括谷胱甘肽过氧化氢化物酶、谷胱甘肽S转移酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原和过氧化氢酶等。同时在BaP压力下US6-1产生的外膜囊泡中，与细胞壁结构稳定性重要蛋白TolA含量较低。这些结果表明外膜囊泡来源于细胞质，其中含有DNA修复酶和大量氧化应激相关的酶，可能参与外膜囊泡的产生和多环芳烃的解毒过程; 4、相比2216E培养条件，在BaP压力下US6-1产生的外膜囊泡中存在着更为完整的TBDT转运系统、Tat蛋白转运系统、Sec蛋白转运系统和RND外排系统相关蛋白。其中TBDT基因NSU_pLA1112在铁限制条件下的表达量显著下降。同时在BaP压力下US6-1产生的外膜囊泡中存在完整的参与萘降解途径的降解酶和BaP降解酶。这些结果表明外膜囊泡可能参与多环芳烃的转运、解毒和降解过程。 上述实验结果说明BaP压力下细胞中活性氧水平上升是诱发新鞘氨醇杆菌US6-1产生外膜囊泡的原因之一。在US6-1在降解BaP和解毒的过程中，氧化激活的BaP可能破坏DNA并产生大量活性氧。为维持细胞稳态，US6-1通过降低细胞壁稳定性，以外膜囊泡形式分泌特定细胞质成分。此外，本研究发现BaP压力下US6-1产生的外膜囊泡还可能参与了多环芳烃的转运、解毒和降解过程。
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