摘要
硅藻因在各种不同环境条件下的成功而成为分布最广泛的微藻，其常常能在营养盐高度多变的动荡环境条件下形成藻华，这可能得益于其复杂的进化史和要素丰富的基因组。硅藻也因在生物地球化学循环和全球气候变化过程中扮演着至关紧要的作用而受到人们的广泛关注。但是，想更全面深入地了解硅藻的进化地位和生理生态特征，需要关于硅藻基因的针对性研究。近来，基因编辑技术在硅藻上的成功应用为硅藻基因研究打开了崭新的大门。本论文以模式硅藻三角褐指藻（P.tricornutum）中潜在的磷酸吡哆醛依赖的转移酶(Phatr3_J55010，Pt55010)为研究对象，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除该基因获得突变株，并结合生物信息学、应用生理学的技术方法，探究三角褐指藻对Pt55010敲除后的响应，阐明该基因的生理生态作用。主要研究结果如下: 1.Pt55010同源基因在硅藻中的分布存在种属间差异，即并非所有硅藻都含有Pt55010的同源基因。而从所有生物范围内来看，Pt55010同源基因也仅仅只分布于甲藻、硅藻和定鞭金藻这三大类群，原核生物中不存在其同源基因，这些结论或许支持了Pt55010是硅藻谱系的起源。此外，Pt55010同源基因的蛋白质亚细胞定位主要是在细胞质和内膜。 2.Pt55010及其同源基因在全球海洋内分布广泛，且其丰度和海区硝酸盐、POC、磷酸盐浓度呈正相关关系。从热带到高纬度海区，均有Pt55010同源基因的分布，但也只分布于甲藻、硅藻和定鞭金藻中，尤以裸甲藻为主(metaG占29％，metaT占18％)。 3.Pt55010及其同源基因是潜在的磷酸吡哆醛依赖的转移酶，且在三角褐指藻中，Pt55010在低氮和光周期开始时表达量高，而在黑暗条件下和光照超过6小时后表达量显著降低。此外，Pt55010还与硝酸还原、谷氨酸合成、亚硝酸还原和分泌蛋白相关基因协同表达，显示其与氮代谢的密切联系。 4.我们利用CRISPR/Cas9基因敲除技术成功获得了三角褐指藻的Pt55010敲除突变体株系Crispr-4-7。经验证，该突变体目的基因缺失了17个碱基，且Pt55010在突变体中的表达量显著下降。 5.基因Pt55010的敲除不会对三角褐指藻的光合活性和氮磷营养盐吸收速率造成显著影响。但是，Pt55010敲除突变体的生长速率和能达到的最大生物量显著降低，而细胞粒径显著增大。与此同时，突变体中脂质含量减少，而单位细胞可溶性蛋白含量增加。 6.Pt55010的敲除会全面影响三角褐指藻的碳氮代谢过程。在突变体中，硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、氨甲酰磷酸合成酶、尿素酶以及苹果酸脱氢酶等相关基因均显著下调，也即在Pt55010被敲除后，三角褐指藻的氮同化、尿素循环和TCA循环均被抑制。此外，突变体中谷氨酸/谷氨酰胺合成、脂质合成、糖酵解等代谢过程相关基因也均下调;而突变体中支链氨基酸降解和精氨酸合成过程相关基因则显著上调。通过GO和KEGG富集分析，我们还发现突变体中核糖体和DNA复制等过程均被显著抑制。 综上所述，Pt55010对三角褐指藻正常生长繁殖以及碳氮代谢调节过程至关重要。Pt55010是这些微藻类群在生态上成功的重要因素。
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