摘要
单细胞蛋白定量是指从单个细胞层面上对不同类型蛋白（胞内蛋白、膜蛋白和分泌蛋白等）进行蛋白浓度或蛋白数量的量化研究。单细胞蛋白定量分析为细胞异质性提供着重要的信息，有助于提升对肿瘤异质性和免疫应答差异的理解。基于常规技术的单细胞蛋白检测方法（如荧光流式细胞术和质谱流式细胞术等）只能实现对膜蛋白分子数的量化，而无法定量胞内蛋白分子数;基于微流控技术（适用于单细胞尺寸研究）的单细胞蛋白检测方法（如微孔阵列法和条形码芯片法等）可以实现对多种类型蛋白分子数的量化，但是检测通量偏低;基于压缩通道的微流式方法，可以实现单一种类胞内蛋白分子数的量化，然而无法实现多种类型蛋白的高通量定量检测。面对上述检测方法的缺陷，本论文提出了基于“均匀光强-压缩通道”检测结构的微流式细胞术检测方法和系统，可以实现单细胞多种类型蛋白分子数的定量检测。此外，还建立了基于压缩通道的单细胞蛋白检测分析仪，可以实现半自动化数据采集和快速数据处理的高通量定量检测。 面对只能实现单一种类胞内蛋白定量检测的问题，本论文首先提出了一种单细胞多种胞内蛋白高通量定量检测方法与系统。基于微流控技术和荧光检测技术，分别从多通道荧光检测、微流控芯片和多蛋白定量算法三方面展开系统研究与设计。基于单激光激发多通道采集的检测方案，提出了一种多蛋白定量荧光补偿算法，解决了多通道荧光串扰带来的多种胞内蛋白定量难题。由于多种荧光标记抗体染色细胞通过微流控芯片压缩通道时可检测到荧光信号，不同浓度抗体溶液检测形成的标定曲线可将原始荧光信号转换为多种蛋白浓度和单细胞尺寸，结合这两者即可实现单细胞多种蛋白分子数的高通量定量检测。基于此方法，在五种肿瘤细胞系中完成了上万细胞量的单细胞三种骨架蛋白分子数定量，并进一步实现了基于不同恶性程度的五种口腔和乳腺肿瘤细胞系和两例口腔临床病人样本的六种重要肿瘤蛋白的应用验证。 为了进一步满足同时定量多种膜蛋白和胞内蛋白的需求，解决流式细胞术无法定量胞内蛋白以及基于压缩通道的微流控方法无法定量膜蛋白的难题，本论文在上述基础上又研究了单细胞多种膜蛋白和胞内蛋白的同时高通量定量检测方法与系统。此部分从均匀光场检测、微流控芯片改进和荧光检测关键参数三方面展开系统研究与设计。利用均匀光场检测模型，在微流控芯片中一定焦深的立体区域内形成固定体积，运用荧光补偿算法得到“蛋白分子数-荧光强度”标定曲线，从而实现荧光蛋白分子数的检测，解决了单个细胞中分布不均匀蛋白种类同时定量的检测难题。基于此方法，在两种肿瘤细胞系中完成了单细胞一种膜蛋白和两种胞内蛋白分子数的同时定量检测，实现了超过90％高精度的细胞分类，为单细胞蛋白分析研究提供了多重参数的定量参考。 为了进一步满足单细胞蛋白定量自动化和快速化的检测需求，本论文在上述基础上还开展了对单细胞蛋白高通量定量检测方法仪器化的研究。利用特定检测区域的荧光标定模型和细胞直径计算方法，在单细胞蛋白分子数高通量定量检测方法基础上，研制单细胞蛋白高通量定量检测分析仪。主要包括微流控芯片模块、荧光采集模块和压力控制模块的硬件模块研制，以及中央控制平台和数据处理平台的软件平台开发。基于硬件模块和软件平台，完成仪器系统集成、组装和测试，并进行临床病人样本的示范应用验证，确定了仪器的检测性能参数。本分析仪检测通量为～104个细胞/小时，检测分辨率为～103个蛋白分子/细胞，检测蛋白分子数动态范围为1.0×103～3.0×107个蛋白分子/细胞。基于此仪器自动化、快速化和可定量的优势，还建立了特定蛋白数据库，可为单细胞蛋白质组学的定量研究提供重要的数据参考。 本论文提出的基于微流控的单细胞多种蛋白高通量定量检测方法与系统，解决了单细胞不同类型蛋白分子数同时定量的难题，进一步完成的仪器化综合研究达到了半自动化高通量检测的效果。基于多种肿瘤细胞系和临床病人样本细胞完成了应用验证，实现了高精度的细胞分类，为单细胞蛋白定量分析提供了新思路。
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