摘要
背景:乳腺癌是女性最常见的肿瘤之一，大多数患者由于发生远处器官转移而预后不良，而乳腺癌转移的分子机制尚需进一步探索。转移前微环境(pre-metastaticniche，PMN)的建立为循环肿瘤细胞的定植和生长提供了一个局部微环境，促进了肿瘤细胞远处转移。外泌体(exosome)是一种装载核酸和蛋白质等物质的细胞外部囊泡，直径30-100nm。外泌体在PMN的形成过程中起到了关键作用。外泌体可以通过改变远处基质细胞的表型和生理功能，形成有利于肿瘤细胞生长的PMN。我们前期的研究发现相比于未发生转移的乳腺癌患者，已经发生转移的乳腺癌患者外周血中外泌体miR-122-5p，miR-193a-5p，miR-320b和miR-375显著上调。 目的:探索乳腺癌外泌体miRNA促进乳腺癌细胞远处转移的具体分子机制。 方法:采用超速离心的方法收集细胞外泌体，透射电子显微镜对其进行鉴定。然后使用PKH67荧光染料验证成纤维细胞WI-38对外泌体的摄取。采用Transwell细胞迁移实验检验外泌体或者miRNA对MDA-MB-231细胞迁移能力的调控作用。WesternBlot分析验证外泌体对WI-38细胞的活化作用，并用透射电子显微镜低倍镜下观察外泌体对WI-38高尔基体形态的影响。使用ELISA方法检测MDA-MB-231外泌体对WI-38细胞分泌蛋白表达的调控作用。采用RT-qPCR检测细胞胞质内部和外泌体内装载的miR-122-5p，miR-193a-5p，miR-320b和miR-375表达水平。使用miRNAmimic通过ELISA实验初步探索miR-122-5p，miR-193a-5p，miR-320b和miR-375对WI-38分泌蛋白表达的影响。然后使用通过上述步骤筛选出的特定miRNAmimic/inhibitor通过ELISA验证MDA-MB-231外泌体miRNA对WI-38细胞分泌蛋白表达的影响。使用Transwell检验MDA-MB-231外泌体miRNA影响WI-38细胞趋化因子分泌促进MDA-MB-231迁移的作用。利用双荧光素酶报告基因验证miRNA直接靶向的下游靶点。WesternBlot和ELISA验证MDA-MB-231外泌体miRNA对WI-38细胞内靶点及其下游分子的调控作用。 结果:透射电子显微镜发现外泌体外观呈圆盘状，直径100nm左右，WesternBlot验证了所提取外泌体表达标志物蛋白TSG101及CD81。通过荧光显微镜低倍镜下观察到WI-38细胞能够摄取MCF10A和MDA-MB-231细胞PKH标记的外泌体。MDA-MB-231外泌体通过调控WI-38细胞来促进MDA-MB-231细胞的迁移。分子水平上发现MDA-MB-231外泌体能够使WI-38表达更多α-SMA，并观察到MDA-MB-231外泌体改变了WI-38细胞高尔基体形态。MDA-MB-231外泌体能够使WI-38细胞分泌MCP-1，SDF-1和层粘连蛋白增多，纤维连接蛋白减少。在MDA-MB-231细胞内miR-122-5p，miR-193a-5p，miR-320b和miR-375表达水平低，而外泌体内含量较高。MDA-MB-231外泌体miR-122-5p可以使WI-38细胞分泌MCP-1，SDF-1和层粘连蛋白增多，纤维连接蛋白减少。Transwell细胞迁移实验发现MDA-MB-231外泌体miR-122-5p能够通过增加WI-38细胞趋化因子MCP-1和SDF-1表达，促进MDA-MB-231细胞迁移。双荧光素酶报告基因结果显示miR-122-5p能够直接靶向MKP-2。随后发现MDA-MB-231外泌体miR-122-5p下调WI-38细胞内MKP-2，通过调控ERK和JNK信号通路，增加MCP-1和SDF-1表达水平。 结论:MDA-MB-231外泌体miR-122-5p能够靶向MKP-2，通过ERK和JNK通路增加WI-38细胞趋化因子MCP-1和SDF-1表达水平，MCP-1和SDF-1进而增强MDA-MB-231细胞的迁移能力，由此促进乳腺癌细胞转移。
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