斑马鱼早期原始生殖细胞转录组及小RNA研究

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中文摘要：原始生殖细胞是个体中最早出现的生殖细胞。原始生殖细胞经过增殖及迁移，到达性腺，再经过一系列的分化最终发育为精子或者卵子。作为一种模式动物，斑马鱼具有体外受精，胚胎透明、易于获取、数量大，原始生殖细胞出现的时间早、易于标记跟踪等优点。所以，与小鼠相比，斑马鱼更适合原始生殖细胞的研究。目前对斑马鱼原始生殖细胞的增殖、迁移等都有一定程度的了解，但是对原始生殖细胞早期发育过程中基因以及小RNA表达的动态变化还知之甚少。为此，我们利用标记原始生殖细胞的转基因斑马鱼，分离了处于不同发育时期的原始生殖细胞，并进行了单细胞转录组学和小RNA组学的分析和研究。我们对斑马鱼原始生殖细胞的三个发育时期（受精后6、11和24小时）进行了单细胞转录组测序，包括了原始生殖细胞增殖及迁移的整个过程。我们发现，随着发育的进行，原始生殖细胞中基因表达的数目呈递减趋势，干性相关基因(genesrelatedtocellpluripotency)的表达量也逐渐降低。受精后6小时与受精后11小时的原始生殖细胞的基因表达模式相似，细胞间的差异性较小。受精后24小时与受精后6和11小时的原始生殖细胞相比，基因表达模式发生了较大的变化，细胞间的差异性也较大，与原始生殖细胞发育有关的基因的表达量显著下调。对基因调控网络与差异表达基因中的基因集合进行功能富集分析，结果显示，在受精后6小时与11小时，原始生殖细胞主要进行细胞分裂和细胞迁移;在受精后24小时，原始生殖细胞主要进行mRNA翻译。小RNA是具有转录后调控功能的一类非编码RNA，广泛影响基因的表达。除了转录组，我们还对受精后6、11和24小时的斑马鱼原始生殖细胞进行了微量小RNA测序。我们发现piRNA的表达量最高（超过一半），绝大部分的piRNA来源于基因组上的转座子区域，说明原始生殖细胞中的piRNA的主要功能可能是抑制转座子的活性。miRNAs的表达量相对较低，我们一共检测到了105种miRNA，随着发育的进行，检测到的miRNA的种类略微上升。在miRNA中，miR-430的表达量占据了绝大部分，随着发育的进行，占比递减。miR-92a-3p和miR-26a-5p的表达量也较高，随着发育的进行，表达量明显上调。已有研究表明miR-430在斑马鱼胚胎及原始生殖细胞发育中有重要功能，但是miR-92a-3p和miR-26a-5p在斑马鱼中的研究较少。为此，我们对它们的功能进行了探索。我们用morpholino反义链胚胎注射的方法分别沉默斑马鱼胚胎中miR-92a-3p与miR-26a-5p的表达，结果显示，沉默miR-92a-3p的胚胎在受精后4天畸形严重，最后致死，说明miR-92a-3p能够影响胚胎的发育。沉默miR-92a-3p的胚胎中的原始生殖细胞与对照组相比，数量和定位均没有差异，说明miR-92a-3p对原始生殖细胞的发育没有作用。沉默miR-26a-5p的胚胎与对照组相比没有差异，说明miR-26a-5p对胚胎及原始生殖细胞的发育没有影响。本研究对斑马鱼原始生殖细胞进行了单细胞转录组学和小RNA组学的测序和分析，发现，原始生殖细胞在迁移前后基因的表达模式较为不同，在迁移停止时原始生殖细胞的干性相关基因的表达量有所下降，显现出分化的趋势。同时，本研究还绘制了原始生殖细胞在增殖和迁移过程中的小RNA表达谱。本研究为进一步认识斑马鱼原始生殖细胞的发育提供了有价值的数据，也为今后开展其他物种原始生殖细胞的研究提供了启示。但是本研究也存在样本数量少，取样时间尺度窄，miRNA功能研究不够充分等不足，在今后的研究中需要加以克服和提高。

作者：

张小元

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关键词：

斑马鱼原始生殖细胞单细胞转录组学小RNA表达谱

授予学位：

博士

学科专业：

发育生物学

导师：

李逸平；吴立刚

学位年度：

2021

学位授予单位：

中国科学院大学

语种：

中文

中图分类号：

Q95