摘要
DhaA可以通过水解脱卤机制催化芥子气的碳-氯键断裂，生成硫二甘醇和氯离子。该催化反应不会生成有毒的产物和中间产物，且催化效率较高，这使得芥子气的无毒害降解成为可能。然而，DhaA的稳定性较差，这限制了它作为生物酶洗消剂的应用。为了解决这个问题，本论文设计了两种方案以改善DhaA的环境稳定性。 第一种方案是用阿拉伯半乳聚糖(Arabinogalactan，AG)对DhaA进行化学修饰。AG的结构特点是高度支链化且羟基含量丰富，因此具有一定保护蛋白质的潜力。 DhaA的修饰产物AG-DhaA的表观分子量为150kDa，其中AG和DhaA的摩尔比为4.5±1.1，其水化体积是DhaA的70倍左右。AG修饰并未明显改变蛋白本身的结构，仅有部分α-螺旋转化为β-折叠。而且AG-DhaA仍保留有91.1％的酶活性，AG-DhaA和DhaA的Km值分别为1.90±0.44和1.64±0.39，酶促动力学参数也在很大程度上得到保留。 与游离的DhaA相比，AG-DhaA的环境稳定性显著提高。在50℃下的半衰期由1.17h延长到了2.01h;在pH3.0中处理1h后的剩余相对活性由10.6％提高到了35.2％;在37℃下的半衰期由27.61h延长到了56.35h;在高盐溶液的半衰期由12.12h延长到了47.48h。 为了进一步提高DhaA的环境稳定性，在多糖修饰DhaA的基础上，本论文还开发了第二种方法。AG-DhaA在最适pH下带有负电荷，可以与带有正电荷的大分子在水相中自组装形成纳米颗粒。本论文选择了两种带有正电荷的大分子:壳聚糖(Chitosan，CTS)和聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)，使其在水相中和分别和带负电荷的AG-DhaA通过静电相互作用，自组装形成纳米颗粒。 其中，PEI-AG-DhaA的粒径为82.97±24.77nm，而CTS-AG-DhaA的粒径为151.36±69.22nm。与AG-DhaA相比，PEI-AG-DhaA和CTS-AG-DhaA颗粒的酶动力学参数和酶活性仅有轻微的损失。 PEI-AG-DhaA和CTS-AG-DhaA的环境稳定性进一步提升。PEI-AG-DhaA和CTS-AG-DhaA在50℃下的半衰期分别由3.28h延长到8.55h和5.66h;在pH3.0条件下处理1h后，其剩余相对活性由22.8％提高到了35.0％和33.4％;在pH4.0条件下处理1h后，其剩余相对活性由36.6％提高到了56.8％和86.2％;在37℃下的半衰期由2.51d延长到了7.39d和5.38d。其中，PEI-AG-DhaA的热稳定性和储存稳定性高于CTS-AG-DhaA;而CTS-AG-DhaA的pH稳定性高于PEI-AG-DhaA。
NETL