摘要
环境病原微生物是指可通过水体、土壤、空气和食物等途径在环境中传播的病原微生物，如大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌(Salmonella)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria Monocytogenes)等。病原微生物可以通过水传播和食品传播等方式进入人体内部，从而感染人群，同时也可能会引起流行性传染病的爆发，导致高发病率和死亡率。传统的病原微生物检测主要通过平板培养法来实现定量检测，但操作时间长且存在局限性。聚合酶链式反应（PCR）、环介导等温扩增反应（LAMP）等核酸检测技术可以将检测时间缩短到几个小时，但普遍存在信噪比低、非特异性扩增、易受复杂基质抑制和操作复杂耗时费力等问题。因此，迫切需要开发一种具有操作简单的核酸检测方法来快速检测真实复杂样品中的病原微生物。本文以大肠杆菌、李斯特菌、沙门氏菌、2019年新冠病毒（2019-nCoV）假病毒及新冠病毒RNA等病原微生物为检测对象，研究水凝胶环介导等温扩增反应体系中信噪比、抗染料干扰、高特异性、扩增效率等相关性能及潜在机制，并在湖水、果汁、奶茶、人全血、猪血、牛血、腐殖酸（HA）、十二烷基硫酸钠（SDS）等环境病原微生物可能存在的不同复杂基质中成功进行检测，同时也对DNA、RNA和病原菌实现了定量计数，并提出了一种可以在现场进行目视计数的快速检测方法，为现场快速检测拓宽了新的研究思路。本文得到的主要研究结论如下： （1）本技术所得到的信噪比为15左右，而传统的基于溶液的扩增方法只有1.5，也具有良好的抗染料干扰能力；本技术具有很高的特异性和灵敏度，可以减少非特异性扩增并达到单拷贝基因检测的水平，从而实现核酸绝对定量分析；与PCR相比，本技术不需要热循环，只需恒温加热即可；本技术不需要对细菌破碎并提取DNA，从而简化实验的步骤，缩短了检测周期并提高了检测效率。水凝胶LAMP技术相关性能增强的原因是其具有高密度的纳米孔结构。同时，纳米孔水凝胶还充当了引物和染料的临时储存库，在引物和染料被消耗时释放出储存的染料和引物，起到了调节体系中引物和染料浓度的作用。 （2）本技术成功在环境样品（HA、SDS、湖水）、临床样品（人全血）、食品样品（奶茶、果汁、牛乳）以及动物样品（牛血、猪血）等复杂基质中进行细菌扩增检测，无需任何样品预处理。水凝胶LAMP技术显著的抗抑制能力主要来源于其交联的纳米多孔结构。一方面，水凝胶中的复杂基质可以被周围的纳米结构吸附和自我净化。来自复杂基质的干扰可以通过水凝胶的自清洁功能来达到消除的预期效果，从而无需进行样品预处理即可成功进行扩增。另一方面，纳米孔中的目标细菌/核酸被高密度的小纳米孔包围并保护着,阻止抑制剂与目标细菌（或基因组）之间的接触，而小分子LAMP试剂仍可穿梭通过纳米孔，使得LAMP扩增反应成功进行。 （3）通过系统的实验条件优化最终得到水凝胶环介导等温扩增反应的最优结果并实现牛乳中DNA和细菌的绝对定量分析，DNA和细菌样品通常经过20min扩增就可以完成定量计数。同时也提供了一种可在现场直接进行目视计数的方法，便于资源匮乏地区使用。 （4）通过系统的实验条件优化最终得到水凝胶逆转录环介导等温扩增反应（RT-LAMP）的最优结果并实现湖水中新冠病毒RNA的绝对定量分析，RNA样品经过5min扩增即可实现定性分析，15min扩增即可完成定量计数。
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