摘要
背景: 非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精、病毒、药物等明确因素所致的，以肝细胞脂肪变性主要特征的临床病理综合征。目前，尚无用于NAFLD治疗的专门药物。达格列净，是新一类降糖药物，通过抑制SGLT-2减少肾葡萄糖重吸收而达到降糖效果。据报道，达格列净可改善2型糖尿病(type2diabetes mellitus，T2DM)和NAFLD患者的肝脏脂肪变性，但具体机制未知。因此，本实验深入研究达格列净能否改善肝细胞脂肪变性及可能的作用机制，为NAFLD的药物治疗提供一定的实验依据。 目的: 采用高脂饮食及棕榈酸(PA)诱导分别构建单纯性脂肪肝体内外模型，研究达格列净对脂肪变性肝细胞脂质沉积的影响及可能作用机制。 方法: 1、选取8周龄ZDF大鼠，高脂饲料诱导4周构建肥胖型糖尿病大鼠模型，实验分为3组:正常组、模型组、达格列净治疗组。高脂饲料喂养9周并予相应处理。每周监测随机血糖和体重变化。大鼠处死后，检测血脂水平;HE、油红O染色观察肝脏脂质蓄积程度;Western blot、免疫组化法测定肝脏自噬相关标志物p62、LC3B、Beclin1表达量及脂质代谢相关蛋白ACC1、ACOX1表达。 2、采用人正常肝细胞系(LO2)和人肝癌细胞系(HepG2)，构建棕榈酸(PA)诱导单纯性脂肪肝细胞模型。检测细胞活力，确定达格列净的最适干预浓度。实验分组如下:正常组、模型组、达格列净治疗组、达格列净+氯喹组、达格列净+AMPK抑制剂（达格列净+Compound C）组。油红O、BODIPY493/503染色检测各组脂质蓄积程度;免疫荧光、Western blot检测LC3B、Beclin1、p62，ACC1、ACOX1表达。免疫组化、Western blot、免疫荧光检测肝组织、LO2和HepG2细胞的SGLT-2表达;Western blot检测AMPK-mTOR信号通路指标进一步探讨自噬发生的可能机制。 结果: 1、药物干预9周后，HE及油红O染色示达格列净改善大鼠肝脏脂质蓄积;Western blot结果示达格列净增加ACC1磷酸化及ACOX1表达。与模型组相比，达格列净增加LC3B、Beclin1表达，降低p62表达; 2、CCK-8检测LO2、HepG2细胞增殖活力，确定达格列净干预浓度为20μM。油红O、BODIPY493/503染色结果示达格列净改善肝细胞脂质蓄积。Western blot结果示与模型组相比，达格列净增加ACC1磷酸化及ACOX1表达。Western blot、免疫荧光结果示与模型组相比，达格列净增加肝细胞LC3B、Beclin1表达，降低p62表达;油红O结果示氯喹(CQ)给药可抑制达格列净的效应。 3、Western blot、免疫组化、免疫荧光结果示SGLT-2在LO2和HepG2细胞中表达。Western blot结果示达格列净增加AMPK表达、降低mTOR磷酸化。油红O结果示Compound C给药可抑制达格列净的效应。 结论: 1、达格列净可改善肥胖型糖尿病大鼠及PA诱导脂肪变肝细胞内脂质沉积; 2、达格列净可能通过增强自噬改善脂肪变肝细胞脂质沉积; 3、AMPK-mTOR信号通路可能参与了达格列净在肝细胞的自噬。
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