具有抗肿瘤活性的含氮杂环类化合物的筛选及作用机制研究

扫码查看

原文链接

NETL

中文摘要：含氮杂环类化合物具有抗肿瘤、抗菌等良好的生物活性，不仅毒副作用小、具有靶向性，且大部分化合物为多靶点化合物。随着新靶点的研究及靶向药物的不断研发，人们发现抑癌基因p53在细胞周期调控、DNA修复、细胞分化和凋亡等方面发挥着重要作用；微管蛋白在有丝分裂纺链体形成、组织细胞结构、细胞内运输及细胞信号转导和分泌等基本的细胞过程也发挥着重要作用。因此，抑癌基因p53及微管蛋白作为抗癌靶点一直备受关注。本研究以课题组研发的含氮杂环化合物为研究对象，初步探究高活性含氮杂环化合物对潜在靶标p53及微管蛋白可能的作用机制，以期为发现高效、低毒的新型含氮杂环类p53及微管蛋白抑制剂奠定基础。现将本论文的工作总结如下：以课题组前期合成的62个含氮杂环类化合物为研究对象开展作用机制初步研究。首先，通过MTT法初步评价其对前列腺癌细胞PC-3、非小细胞肺癌A549、肝癌细胞HepG2、人慢性髓性白血病细胞K562及大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E的体外抗增殖活性。结果发现三唑并噻二嗪类吲哚衍生物Q-12(IC50=9.90±0.85μM)，Q-37(IC50=10.67±1.44μM)，Q-43(IC50=10.47±2.01μM)对PC-3细胞表现出较好的活性，且对大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E的细胞毒性相对较小。进一步从细胞迁移与侵袭、周期与凋亡等方面探讨化合物Q-12、Q-37、Q-43的作用机制。首先，采用划痕及Transwell实验探讨其对细胞迁移和侵袭的影响，结果表明化合物Q-12、Q-37、Q-43具有一定的抑制细胞迁移及侵袭的能力；接着通过Hoechst33258染色、Annexin V-FITC/PI双染、线粒体膜电位测试(MMP)考察化合物诱导PC-3细胞的凋亡情况，结果发现，化合物Q-12、Q-37、Q-43都能诱导PC-3细胞产生不同程度的凋亡现象；最后，采用PI单染法检测了经化合物Q-12、Q-37、Q-43诱导后的PC-3细胞周期的变化，结果发现，化合物Q-12、Q-43诱导PC-3细胞周期阻滞于G2/GM期、Q-37诱导PC-3细胞周期阻滞于G0/G1期。初步探究药物对p53可能的作用机制：选取天然p53缺失的非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299，检测化合物Q-12、Q-37、Q-43对NCIH1299细胞的体外抗增殖活性，结果表明其对NCIH1299的IC50值远高于其它四株癌细胞的体外抗增殖活性；在此基础上，采用RT-PCR及Western blotting实验探讨药物Q-12、Q-43对PC-3细胞内p53和MDM2的mRNA及蛋白表达的影响，结果发现化合物Q-12、Q-43诱导PC-3细胞后，其p53mRNA表达量略上调，而MDM2mRNA表达略下调，分析Western boltting结果表明Q-12、Q-43能略微上调p53蛋白的表达、而MDM2、AKT、P-AKT表达量都微下调；进一步选取MDM2蛋白进行分子对接实验，研究化合物Q-12、Q-43与该蛋白晶体的结合模式及亲和力，结果显示化合物Q-12与Q-43与MDM2蛋白结合评分较低，结合亲和力较弱。综上，推测该类化合物发挥抗增殖活性的作用机制与抑癌因子p53相关性较小。初步探究药物对微管蛋白可能的作用机制：采用免疫荧光应用Tubulin-Red tracker检测化合物Q-12、Q-43对PC-3细胞微管聚合的影响，结果表明随着化合物浓度的增大，微丝的形成不同程度地受阻，高浓度化合物能有效促进微管蛋白聚合；进一步通过透射电镜研究发现，微管聚合物的数量随着药物浓度而增加；选取Tubulin蛋白分子进行分子对接预测其与Tubulin可能的作用模式及结合能力，研究结果发现化合物Q-12、Q-43能与蛋白形成氢键，结合亲和力较高。综上所述，化合物Q-12、Q-43均有一定的抑制细胞增殖，迁移与侵袭，调控周期与凋亡的能力。初步机制研究发现其发挥抗增殖活性的作用机制与p53-MDM2靶点相关性较小，而与微管蛋白的相关性较高，初步确定其可作为新型靶向微管蛋白的先导化合物。本研究为高效低毒的含氮杂环类微管蛋白抑制剂的进一步开发和应用提供了理论和实验依据。

作者：

刘佳敏

展开 >

关键词：

含氮杂环类化合物药物筛选抑癌基因微管蛋白抗肿瘤活性

授予学位：

硕士

学科专业：

药物化学

导师：

王贞超、欧阳贵平

学位年度：

2021

学位授予单位：

贵州大学

语种：

中文

中图分类号：