摘要
目的： 对羟基苯甲酸酯（Parabens，PBs）是一类能够广泛抑制各种微生物的化学防腐剂，其中最常用的是对羟基苯甲酸甲酯、乙酯（Ethylparaben，EtP)和丙酯（Propylparaben，PrP)。长期以来人们认为PBs是安全的，但近年来研究发现它们具有弱雌激素（Oestrogen,E2）效应。E2对雌性生殖过程至关重要，有研究表明PBs暴露会损害雌鼠生育能力，但其具体机制尚不清楚。子宫内膜蜕膜化是妊娠过程的重要环节，蜕膜化受损会导致流产、不孕等不良妊娠结局。但是，目前关于PBs暴露后对子宫内膜蜕膜化的影响尚不明确。课题组前期研究发现对羟基苯甲酸甲酯暴露后小鼠子宫内膜蜕膜化受损。本研究旨在探讨孕早期EtP和PrP暴露对小鼠子宫内膜蜕膜化的影响。 方法： 1.构建正常孕鼠染毒模型：妊娠小鼠从孕第一天（D1）开始，每天分别采用0、400、800和1600mg/kg EtP进行灌胃，或者分别采用0、625、1250和2500mg/kg PrP进行灌胃。孕D5、D7和D8天收集小鼠血清和子宫，进行以下检测： （1）拍照、计数孕鼠着床胚胎数量、称量子宫湿重； （2）Western blot、免疫组化检测小鼠孕D7、D8天子宫内膜蜕膜化标志物同源盒基因A10（Homeobox A10，HOXA10）、基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinase9，MMP9）、骨形态发生蛋白2（Bone morphogenetic protein2，BMP2）的表达； （3）ELISA检测血清E2和孕激素（Progesterone，P4）水平； （4）Real-time PCR检测孕D5天的容受性标志物白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，Lif)、附膜蛋白1(Mucin1，Muc1)和上皮钙黏附蛋白(Epithelial cadherin，E-cad)，以及孕D7天子宫内膜雌激素受体（Oestrogen receptor，ER）和孕激素受体（Progesterone receptor，PR）的表达。 2.人工诱导蜕膜化模型构建：小鼠从假孕第一天（PD1）开始，每天分别采用0和1600mg/kg剂量的EtP进行灌胃，或者分别采用0和2500mg/kg剂量的PrP进行灌胃。假孕PD4天早上，小鼠一侧子宫角注射玉米油以诱导蜕膜化反应，此为刺激侧；另一侧子宫不作任何处理作为对照侧。于假孕PD8天早上取出子宫并进行以下的检测： （1）拍照、称量子宫湿重； （2）Hamp;E染色观察假孕鼠子宫组织形态； （3）Western blot检测刺激侧子宫HOXA10和MMP9的表达； （4）Real-time PCR检测刺激侧子宫蜕膜/滋养层PRL相关蛋白（Decidual/trophoblast PRL-related protein，dtprp）的表达。 3.妊娠结局的观察：小鼠从孕D1-D9天，每天采用0和1600mg/kg EtP进行灌胃，或者采用0和2500mg/kg PrP进行灌胃。孕D9天之后停止染毒，待孕鼠分娩后，记录新生鼠的体重和数量。 结果： 1.孕早期EtP暴露对小鼠子宫蜕膜化的影响 （1）孕早期EtP暴露后小鼠胚胎着床受损。孕D7天和D8天，对照组所有妊娠小鼠着床胚胎数量均大于7；而1600mg/kg EtP暴露后，孕D7天约36%的小鼠其着床胚胎数量＜7，D8天约33%的小鼠其着床胚胎数量＜7。 （2）孕早期1600mg/kg EtP暴露后小鼠孕D5天的子宫重量、着床胚胎数量、以及容受性标志分子Lif、Muc1和E-cad的表达与对照组相比均无显著差异，子宫容受性无明显损伤。 （3）孕早期1600mg/kg EtP暴露后小鼠孕D7、D8天子宫内膜蜕膜化标志分子Hoxa10、BMP2、MMP9的表达显著减少；小鼠假孕PD8天刺激侧子宫MMP9、dtprp和Hoxa10表达显著下调。 （4）孕早期1600mg/kg EtP暴露后小鼠孕D7天血清E2、P4水平显著升高，子宫ER、PR表达显著降低。 （5）孕早期1600mg/kg EtP暴露后小鼠分娩新生鼠数量明显减少。 2.孕早期PrP暴露对小鼠子宫蜕膜化的影响 （1）孕早期PrP暴露后小鼠胚胎着床受损。孕D7天和D8天，对照组所有妊娠小鼠着床胚胎数量均大于7；而2500mg/kg PrP暴露后，孕D7天约36%的小鼠其着床胚胎数量＜7，D8天约25%的小鼠其着床胚胎数量＜7。 （2）孕早期2500mg/kg PrP暴露后，小鼠孕D5天的子宫重量、着床胚胎数量、以及容受性标志分子Lif、Muc1和E-cad的表达与对照组相比均无显著改变。 （3）孕早期2500mg/kg PrP暴露后小鼠孕D7、D8天子宫内膜BMP2、MMP9、Hoxa10的表达显著减少；小鼠假孕PD8天刺激侧子宫MMP9、dtprp和Hoxa10表达显著下调。 （4）孕早期2500mg/kg PrP暴露后，小鼠孕D7天血清E2、P4水平升高，子宫内膜ER、PR表达显著降低。 （5）孕早期2500mg/kg PrP暴露后小鼠分娩新生鼠数量明显减少。 结论： 小鼠孕早期EtP和PrP暴露后，子宫内膜蜕膜化受损，进而阻碍胚胎着床，但其具体机制还有待进一步研究。
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