摘要
黑色素瘤（Melanoma）是一种由异常黑素细胞过度增生引发的，多发生在皮肤的恶性肿瘤，具有极高的侵袭性和致死性，其发病率在全球范围内持续增加。研究表明，大约有40％的黑色素瘤患者存在BRAF基因突变，其中75-90％为BRAFV600E突变。维罗非尼（Vemurafenib）是一种BRAF的靶向抑制剂，也是目前临床上治疗黑色素瘤的一线药物，具有很高的疗效。然而其作用效果维持时间有限，半数患者不到一年便出现获得性耐药使得病情进一步发展。因此明确耐药机制并寻找新的辅助治疗药物来逆转耐药已刻不容缓。 胰岛素受体底物4（Insulin receptor substrate4IRS4）是能够被激活的胰岛素受体酪氨酸激酶作用的底物之一。有学者对乳腺癌的耐药问题进行研究时发现，在乳腺癌细胞转变为耐药细胞的过程中IRS4的表达逐渐升高；过表达IRS4后，乳腺癌细胞对靶向HER2的治疗药物不敏感且细胞中PI3K/Akt通路被激活。同时有研究报道，黑色素瘤耐药的产生可能与MAPK的旁路PI3K/Akt通路的激活或Erk的再激活有关。在本实验中，我们也发现与黑色素瘤亲本细胞相比，耐药细胞中IRS4表达显著增高，因此我们猜测黑色素瘤的耐药可能也与IRS4和PI3K/Akt通路相关。 高三尖杉酯碱（Homoharringtonine HHT）是三尖杉属植物中的一种有效抗癌成分。近年来，研究者们发现高三尖杉酯碱对伊马替尼耐药的白血病病人疗效突出，这引起了人们的广泛关注。除白血病外，高三尖杉酯碱还被用于肝癌、乳腺癌、结直肠癌等多种癌症的治疗。有研究报道，高三尖杉酯碱对黑色素瘤高转移细胞株B16细胞增殖具有很强的抑制作用，但对于维罗非尼耐药黑色素瘤细胞的作用还未见报道。为了明确高三尖杉酯碱对黑色素瘤耐药细胞的影响，机制是否与IRS4有关，我们做了如下探究。 目的： 本文以人黑色素瘤A375细胞株和耐维罗非尼的A375细胞株（A375R）为研究对象，通过高三尖杉酯碱单独或联合维罗非尼作用于耐维罗非尼黑色素瘤细胞，探究其逆转耐药的作用及可能的机制。 方法： 第一部分：1）采用CCK-8法检测维罗非尼对黑色素瘤细胞A375和A375R的细胞增殖抑制率，计算维罗非尼对两种细胞的半数抑制浓度（IC50）和A375R对维罗非尼的耐药倍数；2）通过GEPIA数据库查询IRS4在人体正常细胞及黑色素瘤细胞中的表达情况；RT-qPCR和Western blotting检测IRS4在A375和A375R细胞中基因和蛋白质的表达情况；3）Western blotting检测PI3K/Akt及Erk通路相关蛋白质在A375和A375R细胞中的表达情况。 第二部分：1）检测不同浓度高三尖杉酯碱作用于A375R细胞24、48、72h后对细胞增殖的影响。2）克隆形成实验检测高三尖杉酯碱对A375R细胞增殖的影响；3）流式细胞术检测高三尖杉酯碱对A375R细胞周期的影响；4）Western blotting检测高三尖杉酯碱对周期相关蛋白质（CyclinE1、CDK2）和通路相关蛋白质（IRS4、PI3K、p-Akt）的影响。 第三部分：1）体外培养A375及A375R细胞，CCK-8法检测高三尖杉酯碱处理后两种细胞的存活率，然后以IC10的高三尖杉酯碱联合维罗非尼处理A375R细胞，检测联合用药对A375R细胞的增殖抑制作用。根据上述结果，将后续实验分成四组：Control组、HHT组、Vem组、HHT+Vem组；2）倒置显微镜下观察维罗非尼联合高三尖杉酯碱对A375R细胞形态的影响；3）EdU检测联合用药对A375R细胞增殖的影响；4）通过流式细胞术及Western blotting检测维罗非尼联合高三尖杉酯碱对A375R细胞凋亡的影响；5）Western blotting检测联合用药对IRS4、PI3K/Akt及Erk通路相关蛋白质的影响；6）通过加入IRS4上游IGF-1R/InsR的抑制剂BMS-754807及InsR的激活剂MLR1023来探究高三尖杉酯碱在黑色素瘤耐药细胞中的作用机制。 结果： 第一部分 1.CCK8检测结果显示：维罗非尼对A375和A375R细胞的半数抑制浓度IC50分别为0.94μmol/L和49.09μmol/L，A375R对维罗非尼的耐药倍数RI约为52.22倍。表明A375R细胞具有耐药性，可进行后续实验； 2.GEPIA、RT-qPCR及Western blotting结果显示：IRS4在人体正常细胞及亲本黑色素瘤细胞中几乎不表达，在耐药细胞中基因和蛋白质水平均高表达。 3.Western blotting结果显示：相比于A375细胞，A375R细胞中PI3K/Akt及Erk通路相关蛋白质表达增高。 第二部分 1.高三尖杉酯碱处理A375R细胞后，计算24h的IC50为18.57ng/mL，48h的IC50为9.88ng/mL，72h的IC50为9.23ng/mL。高三尖杉酯碱能明显抑制A375R细胞的增殖，且呈浓度和时间依赖性。采用5、10、20ng/mL的高三尖杉酯碱作用24h进行后续研究。 2.克隆形成实验：与对照组相比，给予5、10和20ng/mL高三尖杉酯碱作用24h，A375R细胞的克隆形成率分别为52.18%、29.72%和2.36%。表明高三尖杉酯碱能有效抑制A375R细胞的克隆形成且呈剂量依赖性。 3.FCM检测细胞周期结果显示：不同浓度的高三尖杉酯碱作用A375R细胞后，A375R细胞G0/G1期比例增加，而S期、G2期比例降低，表明高三尖杉酯碱能将A375R细胞阻滞在G0/G1期。 4.Western blotting结果显示：高三尖杉酯碱可以显著下调周期相关蛋白CyclinE1、CDK2的表达，将细胞周期阻滞在G0/G1期。此外，与对照组相比，高三尖杉酯碱对Akt和Erk蛋白质表达量未见影响，但能够显著下调IRS4、PI3K、p-Akt和p-Erk的蛋白质水平。 第三部分 1.CCK-8结果显示：高三尖杉酯碱能明显抑制A375和A375R细胞，两种细胞IC10均约为2.5ng/mL。IC10的高三尖杉酯碱联合维罗非尼处理A375R后，维罗非尼对A375R细胞的IC50从原来的49.09μmol/L下降到18.90μmol/L，计算得出逆转倍数RF约为2.60倍。根据上述结果，将细胞分为Control组、HHT组（2.5ng/mL）、Vem组（20μmol/L）、Vem+HHT组（20μmol/L+2.5ng/mL）进行后续实验。 2.倒置显微镜下观察显示：与对照组相比，联合用药组细胞数量大幅减少，细胞的生长受到明显的抑制，形态不规则且呈团块状生长。 3.EdU结果显示：联合用药能够抑制细胞增殖，降低细胞绿色荧光强度，同时细胞出现明显的核固缩、核碎裂现象 4.FCM检测细胞凋亡及Western blotting结果显示：对照组细胞凋亡率为7.40±0.03%，HHT组为9.75±0.10%，Vem组为18.18±0.04%，Vem联合HHT组为35.12±0.13%；联合用药还可以明显上调Bax的表达，下调Bcl-2的表达。 5.Western blotting结果显示：Vem联合HHT能够明显降低IRS4、PI3K、p-Akt及p-Erk的表达量。同时使用IRS4上游蛋白IGF-1R/InsR的抑制剂及激活剂后结果显示：HHT组和抑制剂组均可以降低IRS4、PI3K、p-Akt和p-Erk的表达，但激活剂可以增加它们的表达。 结论： 第一部分 1.黑色素瘤耐药细胞A375R确为耐药细胞，可进行后续实验。 2.黑色素瘤耐药细胞中IRS4基因及蛋白质表达明显增高、PI3K/Akt及Erk通路均被激活。 第二部分 1.不同浓度的高三尖杉酯碱能够有效抑制黑色素瘤耐药细胞A375R的增殖，抑制细胞克隆形成能力，阻滞细胞周期在G0/G1期。 2.高三尖杉酯碱可能通过下调IRS4蛋白表达抑制PI3K/Akt及Erk通路的激活,使细胞周期阻滞在G0/G1期,从而抑制黑色素瘤耐药细胞的增殖。 第三部分 1.较低浓度高三尖杉酯碱能够增强黑色素瘤耐药细胞对维罗非尼的敏感性，高三尖杉酯碱联合维罗非尼能够抑制A375R细胞增殖并且诱导细胞凋亡。 2.高三尖杉酯碱可能是通过抑制IRS4/PI3K/Akt及Erk通路来发挥其逆转耐药作用。
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