摘要
研究目的： 前列腺癌（Prostate cancer,PCa）是男性最常见的恶性生殖肿瘤。目前市面上常用的治疗药物为雄激素受体拮抗剂，如比卡鲁胺和恩杂鲁胺。但是长期用药易导致患者出现耐药，加大剂量又会增加药物不良反应。因此，仍需寻找高效低毒的治疗前列腺癌的药物。 细胞内质网的生理学功能主要是合成、加工及运输蛋白质和脂质。当蛋白发生错误折叠或未折叠蛋白堆积，细胞将发生内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ER stress）触发未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）。UPR将激活IRE1α、ATF6和PERK三条信号通路降解这些“废蛋白”以维持内环境的稳态。因此，短期低水平ER stress有助于细胞更好的存活，但长期高强度的ER stress则会导致蛋白被过度降解引起细胞死亡。本课题组前期研究发现内质网应激PERK/eIF2α通路的激活剂—CCT020312能够抑制乳腺癌的生长，而前列腺癌与乳腺癌具有高度的生物学相似性。因此，本研究欲探讨CCT020312是否也可抑制PCa的生长，以用于PCa的治疗？ 研究方法： 一、选择性PERK/eIF2α通路激活剂CCT020312抗前列腺癌的体内外药效研究 1.通过CCK-8实验观察CCT020312对C4-2和LNCaP细胞活力的影响； 2.通过实时无标记细胞增殖实验和细胞克隆实验观察CCT020312对C4-2和LNCaP细胞增殖的影响； 3.通过建立裸鼠体内前列腺癌C4-2细胞皮下移植瘤模型，腹腔注射给予40mg/kg CCT020312，观察CCT020312对裸鼠肿瘤生长及体重的影响。 二、选择性PERK/eIF2α通路激活剂CCT020312抗前列腺癌的机制研究 1.通过流式细胞术探讨CCT020312对C4-2和LNCaP细胞周期的影响； 2.通过流式细胞术和Western blotting检测凋亡相关分子Bcl-2、Bax、Cleaved-PARP、PARP、Cleaved-caspase3、Caspase3蛋白的表达，探讨CCT020312对C4-2和LNCaP细胞凋亡的影响； 3.通过RT-qPCR检测BIP mRNA、ATF4mRNA、CHOP mRNA；Western blotting检测PERK信号通路相关分子BIP、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达；C4-2和LNCaP细胞转染CHOP RNAi后，采用CCK-8实验、流式细胞术再次观察CCT020312对细胞活力和凋亡的影响。通过以上研究探讨CCT020312对C4-2和LNCaP细胞中内质网应激PERK通路的影响； 4.通过RT-qPCR检测自噬相关分子LC3mRNA、Atg5mRNA和Atg8mRNA；Western blotting检测LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg12-Atg5、Beclin1和p62蛋白表达；激光共聚焦实验检测稳定转染GFP-LC3B质粒的C4-2和LNCaP细胞株的绿色荧光变化；电镜实验观察C4-2细胞自噬小体和自噬溶酶体超微结构的形成。通过以上研究探讨CCT020312对C4-2和LNCaP细胞中自噬的影响； 5.通过CCK-8实验检测自噬抑制剂Baf-A1对CCT020312降低PCa细胞活力的影响，探讨CCT020312诱导的细胞自噬的作用； 6.C4-2和LNCaP细胞转染CHOP RNAi后，采用Western blotting检测CCT020312对PCa细胞CHOP、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白表达的影响；以及检测自噬抑制剂Baf-A1对CCT020312上调PCa细胞CHOP、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的影响，探讨PERK信号通路与CCT020312诱导的细胞自噬的关系； 7.通过Western blotting检测裸鼠皮下移植瘤组织中p-mTOR、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP、LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg12-Atg5、Beclin1蛋白表达；免疫组化检测肿瘤组织中增殖指标Ki67、自噬指标LC3和Beclin1；TUNEL实验检测肿瘤组织中凋亡的表达。通过以上研究探讨CCT020312在体内对PERK信号通路、凋亡及自噬的影响。 研究结果： 一、选择性PERK/eIF2α通路激活剂CCT020312抑制前列腺癌的生长 1.CCK-8实验结果表明，CCT020312处理C4-2和LNCaP细胞24h和48h后，可以显著降低细胞活力，且具有较好的剂量和时间依赖性。 2.活细胞实时监测实验及细胞克隆实验结果表明，CCT020312可以明显抑制C4-2和LNCaP细胞的增殖能力。 3.裸鼠皮下移植瘤结果表明，CCT020312可以显著抑制肿瘤的生长，但对裸鼠体重无明显的影响。 二、CCT020312通过激活PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路引起细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡和自噬介导的死亡 1.流式细胞术结果表明，CCT020312可以引起前列腺癌C4-2和LNCaP细胞周期G1期阻滞。 2.流式细胞术及Western blotting结果表明，CCT020312促进前列腺癌C4-2和LNCaP细胞凋亡，并且可显著下调原癌基因Bcl-2蛋白，上调Bax、Cleaved-PARP、Cleaved-caspase3蛋白的表达。 3.RT-qPCR结果表明，CCT020312在水平可上调BIP、ATF4、CHOP mRNA基因的表达；Western blotting结果表明，CCT020312在蛋白水平可显著上调PERK信号通路BIP、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白的表达；CCK-8实验和流式细胞术结果表明，转染CHOP RNAi后能够回复由CCT020312引起的细胞活力降低和细胞凋亡增加。 4.RT-qPCR和Western blotting结果表明，CCT020312可上调自噬相关分子LC3mRNA、Atg5mRNA和Atg8mRNA的表达，上调LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg12-Atg5、Beclin1和p62蛋白的表达；激光共聚焦实验结果表明，在稳定转染GFP-LC3B的C4-2细胞和LNCaP细胞中，绿色荧光在未加药组呈弥散状态，而经CCT020312处理后，绿色荧光由弥散变成斑点状；电镜实验观察到CCT020312能够诱导C4-2细胞中自噬溶酶体的形成。 5.CCK-8结果表明，自噬抑制剂Baf-A1能够回复CCT020312引起的细胞活力降低。 6.CHOP RNAi能够回复由CCT020312上调的CHOP、LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白的表达；但自噬抑制剂Baf-A1不能够回复由CCT030212引起的CHOP蛋白的上调。 7.CCT020312能够在体内下调p-mTOR，上调BIP、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP、LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg12-Atg5、Beclin1蛋白表达；免疫组化结果显示，与对照组相比，CCT020312给药组的Ki67表达较低，LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1的表达较高；TUNEL检测结果显示，与对照组相比，CCT020312给药组红色荧光亮度增强，表明凋亡细胞数量增加。 研究结论： CCT020312能够在体内和体外抑制前列腺癌的生长。其作用机制与激活内质网应激PERK通路，促进前列腺癌C4-2和LNCaP细胞周期G1期阻滞，诱导细胞凋亡和自噬介导的死亡有关。
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