摘要
目的：中药材巴戟天(Morinda officinalis How)在中国以及世界各地的传统医学中广泛用作治疗药材和保健食品。常见易混药材因外观与巴戟天相似，常规手段难以区分且存在诸多弊端。本课题设计一组环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)引物，通过条件优化确定反应体系，建立使用LAMP技术快速鉴别巴戟天的方法，为中药材品种的分子鉴定提供新依据。 方法：收集巴戟天、羊角藤(Morinda umbellata L.)、虎刺(Damnacanthus indicus)、铁箍散(Schisandra propinqua var.Sinensis)、海滨木巴戟(Morinda citrifolia L.)、鸡眼藤(Morinda parvifolia)、白木通(Akebia trifoliata subsp.Australis)、南五味子(Kadsura longipedunculata Finet et Gagnep)药材，提取DNA并测定浓度和质量后用TE缓冲溶液稀释调节至10ng/μL，于-20℃下保存直至使用。经多重序列比对，以巴戟天内部转录间隔区2(ITS2)序列为模板设计、挑选最优引物建立LAMP检测方法，并评估该方法的特异性和灵敏度。使用从巴戟天与其他植物提取的DNA以相同的实验条件进行LAMP检测实验，若有且仅有巴戟天能够成功进行扩增反应，则说明特异性良好。将巴戟天基因模板进行梯度稀释，与常规PCR方法进行对比实验从而评价灵敏度。为了进一步提高检测效果，结合响应面方法对温度和反应体系等对扩增过程影响较大的反应条件进行多因素、多水平条件优化。首先，根据Plackett-Burman实验的结果数据筛选出三种影响最高的主要因素，以其变化程度为爬坡方向，设计一系列步长路径；然后以Box-Behnken实验中心组合的原理，利用软件给出条件进行三因素三水平的响应面分析实验。最后将所得结果进行统计数据分析，得出一个能够达到最高荧光强度的最优反应条件并加以验证。 结果：结合DNA条形码技术，以ITS2序列为目的基因，设计优选出一套能特异性检测巴戟天的LAMP引物。LAMP反应可在63℃下40~60分钟内完成，且在24小时内、一周后、一个月后、六个月后都能获得良好的客观检测效果。建立的三种LAMP检测方法，包括荧光目视检测方法、琼脂糖凝胶成像法和实时荧光定量法，都具有简便、客观、易于定量的优点。特异性实验结果显示，LAMP技术可按照预期特异性扩增巴戟天样品，与其他植物序列形成颜色、电泳条带以及扩增曲线的显著差别，鉴别结果客观、明显。灵敏度实验结果表明，在10fg/μL~100pg/μL浓度范围内，该方法的DNA浓度最低检测限约为100fg/μL，与常规PCR方法对比更为灵敏。通过对KCl、(NH4)2SO4、Tris-HCl、dNTPs、MgSO4、FIP/BIP、F3/B3、Tween20、甜菜碱、聚合酶、温度的显著性影响进行筛选，对反应过程影响最高的三种因子分别是温度、引物F3/B3和MgSO4的浓度。经过多因素条件优化，在63℃、5.02pmol F3/B3和8.11mM MgSO4条件下可得到最大荧光强度，为最优检测条件，验证结果与预测结果一致。 结论：LAMP技术对巴戟天的鉴别具有准确度高、特异性强且评定客观的优势。该方法设备要求低、操作简便、快速，拓展了中药材检测方法，具有进一步商业化应用的潜力。
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