摘要
目的： 通过观察平喘颗粒对哮喘小鼠肠道菌群的影响及其介导的IL33/ST2/ILC2s信号轴相关因子的表达，探讨平喘颗粒通过调控肠道菌群介导的IL33/ST2/ILC2s信号轴对哮喘小鼠气道上皮黏膜屏障、气道炎症影响的作用机制。 方法： 1.实验一：30只C57BL/6N小鼠被随机分为3组，每组10只，分别为空白组、模型组、平喘颗粒组。除空白组外，模型组、平喘颗粒组均使用O VA雾化、激发的方法构建哮喘小鼠模型。在第21天，平喘颗粒组小鼠给予平喘颗粒（0.1ml/10g）灌胃，空白组和模型组给予生理盐水（0.1ml/10g）灌胃，持续给予4周，日1次。在最后一次激发后24h内通过EMKA体积描记仪检测各组小鼠AHR；通过HE染色、PAS染色法观察各组小鼠肺组织病理形态学的变化；通过显微镜检测各组小鼠BALF中总细胞、EOS、Neu及Lym计数；通过16S rDNA基因测序检测各组小鼠粪便肠道菌群中alpha多样性分析、Beta多样性分析、物种组成分析、LEf Se分析及KEGG功能预测。 2.实验二：60只C57BL/6N小鼠随机分为6组，每组10只，分别为空白组、无菌组、模型组、模型无菌组、模型+平喘颗粒组、模型无菌+平喘颗粒组。无菌组、模型无菌组、模型无菌+平喘颗粒组在哮喘造模之前每天上午给予头孢哌酮舒巴坦钠-盐酸万古霉素生理盐水溶液20μL/只灌胃，空白组、模型组、模型+平喘颗粒组给予生理盐水20μL/只灌胃，持续7天。模型无菌组、模型无菌+平喘颗粒组、模型组、模型+平喘颗粒组小鼠哮喘造模方法同实验一；各组小鼠肺组织病理检测及BALF中炎性细胞检测同实验一。ELISA法检测各组小鼠BALF中IL-4、IL-5及IL-13水平。 3.实验三：40只C57BL/6N小鼠被随机分为4组，每组10只，分别为空白组、模型组、平喘颗粒组、鼠李糖乳杆菌组。鼠李糖乳杆菌组小鼠在哮喘造模之前给予鼠李糖乳杆菌灌胃，剂量为5×105cfu/ml200μL，每周4次，疗程为6周。模型组、平喘颗粒组、鼠李糖乳杆菌组小鼠哮喘造模方法同实验一；各组小鼠肺组织病理检测及BALF中炎性细胞检测同实验一；各组小鼠BALF中炎性因子检测同实验二；ELISA法检测各组小鼠BALF中IL-33水平；免疫荧光、Western blot法及qRT-PCR法检测各组小鼠肺组织中ZO-1、Occludin蛋白及mRNA表达水平；免疫组化、Western blot法及qRT-PCR法检测各组小鼠肺组织中IL-33、ST-2蛋白及mRNA表达水平；流式细胞术检测各组小鼠肺组织中ILC-2s阳性细胞表达率。 结果： 实验一： 1.与空白组比较，模型组小鼠气道反应性升高，平喘颗粒组小鼠气道反应性较模型组有所改善，差异有统计学意义（Plt;0.05）。 2.HE染色：空白组小鼠肺组织HE染色显示无明显哮喘相关病理改变；与空白组相比，模型组小鼠肺组织HE染色可见大量哮喘相关的炎性细胞浸润；与模型组相比，平喘颗粒组哮喘相关病理改变及炎性细胞浸润等病理特征减轻。 3.PAS染色：空白组小鼠肺组织PAS染色无明显气道上皮杯状细胞增生及气道黏液增多的哮喘相关病理征象；与空白组相比，模型组小鼠肺组织PA S染色可见气道黏液及杯状细胞明显增多；与模型组相比，平喘颗粒组小鼠气道黏液及杯状细胞等哮喘相关病理征象明显减轻。 4.与模型组比较，平喘颗粒组小鼠BALF中总细胞、EOS、Neu和Lym计数明显降低（Plt;0.01）。 5.alpha多样性分析：平喘颗粒可使哮喘小鼠的Chao1指数、Shannon指数及ACE指数明显回升，Simpson指数下降，影响其肠道菌群物种的总数及多样性。 6.Beta多样性分析：PCA分析、PCoA分析及PLS-DA结果显示空白组、模型组及平喘颗粒组小鼠肠道菌群组成具有明显差异。 7.物种组成分析：从肠道菌群的菌科至菌属水平，空白组、模型组及平喘颗粒组小鼠肠道菌群明显不同，且平喘颗粒干预后可改变哮喘小鼠肠道菌群结构，其中以乳酸杆菌属最为明显。 8.LEf Se分析：平喘颗粒可恢复乳酸杆菌属的丰度。 9.KEGG功能预测：平喘颗粒组可影响多糖的生物合成、转运及代谢，调控细胞运动性。 实验二： 1.HE染色：空白组、无菌组小鼠肺组织HE染色无明显哮喘相关病理改变；与空白组、无菌组相比，模型组、模型无菌组小鼠肺组织HE染色可见哮喘相关炎性细胞浸润，气道壁明显增厚，气道管腔出现不同程度狭窄；与模型组、模型无菌组相比，模型无菌+平喘颗粒组、模型+平喘颗粒组上述病理特征均减轻，而模型+平喘颗粒组较模型无菌+平喘颗粒组病理变化减轻更为明显。 2.PAS染色：空白组、无菌组小鼠肺组织PAS染色无黏液增多等相关哮喘病理征象；与空白组、无菌组相比，模型组、模型无菌组小鼠肺组织PA S染色可见气道黏液增多；与模型组、模型无菌组相比，模型无菌+平喘颗粒组、模型+平喘颗粒组上述症状均明显减轻，且模型+平喘颗粒组较模型无菌+平喘颗粒组病理变化减轻更为明显。 3.模型组、模型无菌组小鼠BALF中总细胞、EOS、Neu及Lym计数均较空白组、无菌组明显增加（Plt;0.01）；模型+平喘颗粒组及模型无菌+平喘颗粒组小鼠BALF中总细胞、EOS、Neu及Lym计数均低于模型组、模型无菌组（Plt;0.01）；且模型无菌+平喘颗粒组小鼠BALF中总细胞、EOS、Neu及Lym计数均高于模型+平喘颗粒组（Plt;0.01）。 4.ELISA法结果显示：模型组、模型无菌组小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平均较空白组、无菌组明显升高（Plt;0.01）。模型+平喘颗粒组及模型无菌+平喘颗粒组小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平均较模型组、模型无菌组明显降低（Plt;0.01）。模型无菌+平喘颗粒组BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平均高于模型+平喘颗粒组（Plt;0.05）。 实验三： 1.HE染色：与模型组相比，平喘颗粒组、鼠李糖乳杆菌组中炎性细胞浸润、平滑肌细胞增生等病理特征均减轻，而平喘颗粒组哮喘相关病理变化减轻更为明显。 2.PAS染色：与模型组相比，平喘颗粒组、鼠李糖乳杆菌组气道上皮杯状细胞增生等哮喘相关病理征象明显减轻，而平喘颗粒组病理变化减轻更为明显。 3.平喘颗粒组、鼠李糖乳杆菌组小鼠BALF中总细胞、EOS、Neu及Lym计数较模型组均明显降低（Plt;0.01），而平喘颗粒组降低程度较鼠糖李杆菌组更为明显，比较有统计学差异（Plt;0.01）。 4.ELISA法结果显示：平喘颗粒组、鼠李糖乳杆菌组小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13和IL-33水平均较模型组明显降低（Plt;0.01）；而平喘颗粒组上述炎性因子水平降低程度较鼠李糖乳杆菌组更为明显，比较有统计学差异（Plt;0.05）。 5.免疫荧光、Western blot法及qRT-PCR检测结果显示：模型组小鼠肺组织中ZO-1、Occludin蛋白及mRNA表达水平较空白组明显降低（Plt;0.01）；平喘颗粒组及鼠李糖乳杆菌组小鼠肺组织中ZO-1、Occludin蛋白及mRNA表达水平均高于模型组（Plt;0.01），但低于空白组（Plt;0.01）；平喘颗粒组小鼠肺组织中ZO-1、Occludin蛋白及mRNA表达水平高于鼠李糖乳杆菌组（Plt;0.01）。 6.免疫组化、Western blot法及qRT-PCR检测结果显示：模型组小鼠肺组织中IL-33、ST-2蛋白及mRNA表达水平较空白组明显增加（Plt;0.01）；平喘颗粒组及鼠李糖乳杆菌组小鼠肺组织中IL-33、ST-2蛋白及mRNA表达水平均低于模型组（Plt;0.01），但高于空白组（Plt;0.01）；平喘颗粒组小鼠肺组织中IL-33、ST-2蛋白及mRNA表达水平低于鼠李糖乳杆菌组（Plt;0.01）。 7.流式细胞术结果显示：模型组小鼠肺组织中ILC-2s阳性细胞率较空白组明显升高（Plt;0.01）；平喘颗粒组及鼠李糖乳杆菌组小鼠肺组织中ILC-2s阳性细胞率明显低于模型组（Plt;0.01），但仍高于空白组（Plt;0.01）。平喘颗粒组小鼠肺组织中ILC-2s阳性细胞率低于鼠李糖乳杆菌组（Plt;0.01）。 结论： 1.平喘颗粒可以减轻哮喘小鼠气道高反应、炎性细胞浸润等气道炎症的病理变化，改善其肠道菌群结构，保护其气道上皮黏膜屏障功能。 2.平喘颗粒可以降低哮喘小鼠BALF中炎性细胞及炎性因子水平。 3.平喘颗粒可以降低哮喘小鼠肺组织中IL-33、ST-2蛋白及mRNA表达水平，升高其肺组织中ZO-1、Occludin蛋白及mRNA表达水平，降低其肺组织中ILC-2s阳性细胞率。 4.平喘颗粒通过肠道菌群介导的IL33/ST2/ILC2s信号轴改善气道上皮黏膜屏障抑制哮喘气道炎症。
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