摘要
本文以贵州本地黄牛（威宁牛、关岭牛、思南牛）、贵州杂交牛和安格斯牛为研究对象，采用RT-PCR克隆MSTN基因cDNA并进行生物信息学分析，利用PCR-SSCP法、PCR-RFLP法结合直接测序法筛选MSTN基因多态位点，用ELISA方法测定血浆中MSTN蛋白浓度并与不同品种牛MSTN基因多态性进行关联分析，最后分析了MSTN基因多态性与生长性状有关联性的多态位点，为MSTN基因在贵州优质黄牛的选育提供理论依据。研究结果总结如下： 1.贵州杂交黄牛MSTN基因cDNA的克隆及生物信息学分析 利用RT-PCR克隆贵州杂交黄牛MSTN基因cDNA序列，发现4个碱基突变位点，其中3个为错义突变：外显子1第76bpA→G突变引起天冬酰胺变为天冬氨酸，外显子1第79bp处A→G突变引起丝氨酸变为甘氨酸，外显子3第1066bp处G→A突变引起谷氨酸变为赖氨酸；外显子2第267bp处A→G突变为同义突变。生物信息学分析结果表明，贵州杂交黄牛MSTN蛋白基本理化性质和结构与普通牛基本一致，具有一个跨膜结构区域，在信号肽区域含有酸性亲水性蛋白，蛋白理论大小值约为42.43kDa；通过基因同源性和系统进化树，结合motif、蛋白保守域和结构域分析认为MSTN基因在哺乳动物中高度保守，但存在遗传多样性。3个错义突变位点的出现，导致其mRNA二级结构及稳定性发生改变；同义突变引起密码子偏好性发生改变。 2.MSTN基因多态位点分析 采用PCR-SSCP法结合直接测序法，在贵州本地黄牛、杂交牛和安格斯牛中筛出3个多态位点，分别为：位于EXON1上的g.6279107Ggt;C突变，处于CDS区第111位，形成2种基因型GG和GC，威宁牛在此位点为低度多态（PIClt;0.25），关岭牛与思南牛为中度多态（0.25lt;PIClt;0.5）；位于EXON2上的g.6281238Tgt;C突变，处于CDS区第414位，产生3种基因型TT、TC和CC，威宁牛、思南牛和安格斯牛在此位点均为中度多态；位于EXON3的g.6283933Agt;C突变，处于CDS区第1077位，构成3种基因型AA、CA和CC，威宁牛、关岭牛和思南牛均为中度多态。但是利用PCR-RFLP法未在4个品种牛和杂交牛群体的MSTN基因5''非翻译区筛出多态位点。3个多态位点均未偏离Hardy-Weinberg平衡状态，能提供合理的遗传信息。连锁不平衡分析表明3个SNPs间不存在强连锁平衡，单倍型分析表明3个SNPs可以构建6个单倍型和13种双倍型。生物信息学分析表明3个SNPs引起密码子偏好性和mRNA二级结构、稳定性发生改变，以及外显子剪切增强子的改变。 3.MSTN基因多态位点与血浆MSTN蛋白浓度相关性分析 贵州本地黄牛与杂交牛血浆MSTN蛋白ELISA检测结果表明杂交牛MSTN浓度显著低于关岭牛、思南牛MSTN浓度（Plt;0.05）。将3个SNPs位点与所测MSTN蛋白浓度进行关联性分析，得到2个多态位点与MSTN蛋白浓度有关联。其中，威宁牛与关岭牛、思南牛MSTN浓度在g.6279107Ggt;C突变位点不同基因型间极显著差异（Plt;0.01）；威宁牛与思南牛MSTN浓度在g.6283933Agt;C突变位点不同基因型间差异显著（Plt;0.05）。将3个SNPs位点产生的13个双倍型与MSTN浓度进行关联性分析，发现H3H5双倍型个体MSTN浓度显著低于H1H5、H3H4双倍型个体（Plt;0.05）。杂交牛血浆中MSTN浓度低于贵州本地黄牛血浆MSTN浓度也说明了杂交牛生长快的主要原因。 4.MSTN基因多态位点与生长性状关联性分析 将4个品种牛和杂交牛群体的MSTN基因筛选出3个多态位点与其生长性状进行关联性分析，只有2个位点与生长性状存在关联性。在MSTN基因g.6279107Ggt;C突变中，威宁牛GG型个体的胸围、管围及体高都显著高于GC型个体（Pgt;0.05）；在MSTN基因g.6281238Tgt;C突变位点中，威宁牛TT型个体的体重与体高显著高于TC型个体（Pgt;0.05）；安格斯牛TT型个体、TC型个体的胸围显著高于CC型个体（Plt;0.05）；思南牛杂合的TC型与突变后纯合的CC型，且TC型各生长性状指标都高于CC型个体，但差异不显著（Pgt;0.05）；贵州杂交牛在此位点只存杂合的TC型个体。初步认为g.6281238Tgt;C突变具有影响贵州本地黄牛生长性状的潜力，提示T等位基因可能与牛生长性状有关。
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