摘要
自然界中，有一些病原真菌可以造成植物真菌病害。化学杀菌剂的使用带来了严重的环境问题。因此，越来越多的人将目光投向了生物农药。大多数植物病原真菌的细胞壁中主要成分为几丁质，这就使几丁质酶成为了潜在的抗真菌药剂。本文以黑曲霉的B类几丁质酶AnChiB和玉米螟中肠的Ⅳ家族几丁质酶OfChtⅣ为研究对象，根据生理功能推测并验证了抗真菌活性，研究了结构功能关系，主要实验内容和结果如下： 1.AnChiB的抗真菌活性研究。从AnChiB的生理功能出发，测定了它对黑曲霉菌丝体的水解能力，水解8h后可以生成1.4mM(GlcNAc)2。随后测试了它的抗真菌活性。结果显示，AnChiB对细胞壁主要成分为纤维素的致病疫霉的生长没有影响，而对细胞壁主要成分为几丁质的镰刀菌具有23%的生长抑制率。表明AnChiB的抗真菌活性与其对真菌细胞壁中的几丁质水解相关。 2.AnChiB的结构功能研究。比较了AnChiB与另外一种来自昆虫表皮降解过程的关键几丁质酶OfChtⅠ的菌丝体降解活性，发现AnChiB的水解菌丝体效率明显高于OfChtⅠ，水解8h后(GlcNAc)2生成量相差8.7倍。解析获取AnChiB的晶体结构，整体上与OfChtⅠ结构相似，是由典型的(β/α)8-桶状的核心结构域和几丁质插入域组成。不同的是，AnChiB在底物结合裂缝的非还原端有一个LOOP结构，包含Trp106和Trp118，推测可能与菌丝体水解效率有关。将AnChiB的Trp106突变为Ala106后，菌丝体水解活性下降75%，验证了该色氨酸对于AnChiB水解菌丝体的重要性。 3.OfChtⅣ的抗真菌活性研究。检测到OfChtⅣ对镰刀菌具有40%的生长抑制率，表明其具有优于AnChiB的抗真菌活性。同时也检测到OfChtⅣ对其它几种玉米病原真菌也具有抗性。由于玉米常常会被真菌侵染，因此这可能对应了OfChtⅣ在玉米螟体内起到的免疫功能。随后，对这几种真菌菌丝体进行了水解实验，其水解效率与抗真菌效果相一致，从而表明了OfChtⅣ的抗真菌活性也是来自于对菌丝体的水解。 4.OfChtⅣ的结构功能研究。用玉米螟中肠提取物处理OfChtⅣ和它的去糖基化突变体，来研究酶在中肠多种蛋白酶环境下的适应机制。结果显示野生型不被降解且保持酶活；但突变体会被降解90%以上，失去90%的酶活。表明了糖基化对酶在中肠条件下的保护作用。解析晶体结构发现OfChtⅣ表面存在多个蛋白酶酶切位点，进一步表明了糖基化对酶的保护作用。通过对比分析，发现OfChtⅣ中静电相互作用的总数明显低于常见昆虫几丁质酶，可能促进了其在中肠碱性条件下稳定性。另外，OfChtⅣ在结构上相比昆虫几丁质酶更加类似于具有抗真菌活性的植物几丁质酶。解析了酶与底物复合物以及与抑制剂复合物的晶体结构，有利于对酶作用方式的更好理解。
NETL