摘要
目的： （1）构建C57BL/6小鼠MC-38负瘤模型。（2）通过观察和处理两组小鼠肿瘤、外周血和部分组织器官标本，分析SLC5A8基因对负瘤鼠免疫微环境的影响。 方法： （1）复苏并传代MC-38细胞株，在应用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠SLC5A8基因的基础上，构建两组C57BL/6小鼠MC-38负瘤模型。（2）实验分组：将C57BL/6小鼠分为两组，每组4只，即敲除SLC5A8基因的负瘤鼠为实验组（KO组）、普通负瘤鼠为对照组（WT组）。两组小鼠均为8-12周，重量18-22g，雌鼠。负瘤鼠模型均采用背部皮下种植MC-38细胞株的方法构建。（3）每天观察并记录实验组和对照组负瘤鼠背部皮下结肠肿瘤的生长增殖情况，包括每天测量肿瘤体积和解剖测量离体瘤重等，计算肿瘤体积抑制率、瘤重抑制率并绘制肿瘤生长曲线。（4）采用流式细胞学技术测得实验组和对照组小鼠肿瘤和外周血中T淋巴细胞、巨噬细胞水平，分析SLC5A8基因对负瘤鼠肿瘤和外周免疫微环境中免疫细胞的影响。（5）采用ELISA法检测实验组和对照组小鼠外周血中IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β水平，分析SLC5A8基因对负瘤鼠外周免疫微环境中免疫因子的影响。（6）采用切片HE染色法镜下观察两组小鼠皮下肿瘤及部分器官的组织结构变化，分析SLC5A8基因对负瘤鼠部分器官镜下结构的影响。 结果： （1）成功构建两组C57BL/6小鼠MC-38负瘤模型，成瘤率100%，皮下种植MC-38细胞株30天后结束实验。（2）结肠肿瘤皮下生长状况：与WT组相比，KO组小鼠肿瘤生长明显更快、体积明显更大（P＜0.01）、肿瘤重量显著增加（P＜0.01）。（3）在小鼠肿瘤组织中，与WT组相比，KO组小鼠肿瘤组织中CD3+T细胞(%)、CD4+T细胞(%)降低（P＜0.05），CD8+T细胞(%)显著降低（P＜0.01）。M1型巨噬细胞(%)降低（P＜0.05），M2型巨噬细胞(%)显著升高（P＜0.01）。（4）在小鼠外周血中，与WT组相比，KO组小鼠外周血中CD3+T细胞(%)、CD4+T细胞(%)和CD8+T细胞(%)显著降低（P＜0.01）。M1型巨噬细胞(%)显著降低（P＜0.01），M2型巨噬细胞(%)显著升高（P＜0.01）。（5）与WT组相比，KO组小鼠外周血中IL-6和TNF-α因子的浓度显著降低（P＜0.01）。IL-10和TGF-β因子的浓度显著升高（P＜0.01）。（6）HE染色：①肿瘤：与对照组相比，实验组小鼠肿瘤组织显微镜下可见肿瘤细胞胞核深染，异型性更大，细胞密度严重不均，细胞结构形态各异，炎症反应更加明显，炎症细胞多见，遍布视野。②结肠：与对照组相比，实验组小鼠结肠组织镜下可见结肠的粘膜层受损更加严重，粘膜及粘膜下层下水肿，细胞排列更加紊乱，部分结肠隐窝阙如，结肠肌层水肿，炎症细胞丰富多见，遍布视野。③胸腺和脾脏：两组未见明显差异。 结论： （1）SLC5A8基因可抑制C57BL/6小鼠结肠肿瘤在皮下的生长与增殖。 （2）SLC5A8基因对负瘤小鼠免疫微环境有积极影响，能抑制肿瘤进展。而缺乏该基因，会降低负瘤鼠肿瘤及外周免疫微环境中免疫T淋巴细胞水平，同时抑制M1型巨噬细胞的活化，促进M2型巨细胞的活化，且会降低外周血IL-6和TNF-α因子浓度，升高IL-10和TGF-β因子浓度，进而促进肿瘤进展。 （3）SLC5A8基因对器官组织的免疫屏障有保护作用，而缺乏该基因，小鼠皮下肿瘤及结肠组织炎症反应更加明显，免疫屏障受损更加严重，更有利于肿瘤的发生与发展。
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