摘要
目的 糖尿病（diabetesmellitus，DM）是一种严重危害人类健康的慢性非传染性疾病，其患病率正快速上升。糖尿病血管并发症是糖尿病最常见的慢性并发症，以血管内皮功能紊乱为主要特征。华法林是一种双香豆素衍生物，是目前抗凝治疗的主要药物之一，但对血管内皮功能的作用仍不十分明确。本课题通过细胞和动物实验研究华法林对血管内皮功能的调节作用，希望阐明华法林对糖尿病血管并发症改善的作用机制。 方法 第一部分华法林对糖尿病血管内皮功能作用的探究 1、华法林处理HAEC细胞，采用MTT实验检测细胞生长活性； 2、华法林处理HAEC细胞，通过Westernblot实验检测p-eNOS和eNOS的变化情况，并确认华法林的最适浓度和时间； 3、离体培养C57BL/6小鼠主动脉血管，华法林处理48h后检测血管舒张功能； 4、离体培养db/m小鼠、db/db小鼠主动脉血管，华法林处理48h后检测血管舒张功能。 第二部分华法林可部分恢复糖尿病血管内皮依赖性功能障碍机制的探究 1、AGEs和ox-LDL单独处理HAEC细胞，MTT实验检测细胞生长活性，并确定药物的最适浓度和时间； 2、细胞流式仪分析经AGEs、ox-LDL处理后，在有无华法林干预的情况下，HAEC细胞的细胞死亡影响； 3、AGEs和ox-LDL单独处理HAEC细胞后，通过Westernblot实验检测p-eNOS和eNOS的变化； 4、通过DCFH-DA探针及细胞流式仪分析经AGEs、ox-LDL处理后，华法林的有无对HAEC细胞内ROS的影响； 5、经AGEs、ox-LDL、华法林单独处理或者联合干预HAEC细胞后，通过Westernblot实验检测p-eNOS和eNOS的变化情况； 6、经AGEs、ox-LDL、华法林单独处理或者联合干预HAEC细胞后，通过Westernblot实验检测p-AKT和AKT的变化情况。 结果 第一部分华法林对糖尿病血管内皮功能作用的探究 1、华法林处理HAEC细胞后，对细胞的生长活性无明显影响； 2、HAEC细胞经华法林处理后p-eNOS/eNOS上调，最适处理浓度为20μg/ml，最适处理时间为48h； 3、与CTRL组相比，华法林对C57BL/6小鼠主动脉血管内皮依赖性舒张功能有较明显的促进作用； 4、与db/m小鼠相比，db/db小鼠主动脉血管内皮依赖性舒张功能显示出显著障碍，经华法林处理后，db/db小鼠主动脉血管内皮依赖性舒张功能得到部分恢复。 第二部分华法林可恢复部分糖尿病血管内皮依赖性功能障碍机制的探究 1、经AGEs和ox-LDL处理后HAEC细胞的生长活性下降，AGEs最适浓度为100μg/ml，ox-LDL最适浓度为90μg/ml，最适时间均为48h； 2、华法林能减少由AGEs和ox-LDL诱导的HAEC细胞死亡； 3、AGEs处理后，HAEC细胞p-eNOS/eNOS下调；ox-LDL处理后，HAEC细胞p-eNOS和eNOS表达量均下调； 4、华法林能减少由AGEs和ox-LDL诱导的HAEC细胞ROS的积累； 5、华法林能部分恢复由AGEs诱导的HAEC细胞p-eNOS/eNOS的下调；及部分恢复由ox-LDL诱导的HAEC细胞p-eNOS和eNOS表达的下调； 6、华法林能部分恢复由AGEs和ox-LDL诱导的HAEC细胞p-AKT/AKT的下调。 结论 华法林能够促进内皮细胞功能，且对内皮细胞无明显毒性，并对小鼠主动脉血管内皮依赖性舒张功能有促进作用。在细胞水平上阐明了华法林能够缓解由AGEs和ox-LDL诱导的氧化应激，通过PI3K/AKT/eNOS途径改善由AGEs和ox-LDL诱导的内皮细胞功能障碍。
NETL