摘要
核酸外切酶III(ExoIII)由于不需要特定识别序列就能选择性识别并水解双链DNA的3''平末端或3''凹末端，它在构建DNA信号扩增的生物传感器方面有着广泛的应用。随着对小分子和蛋白质之间相互作用的深入研究，小分子部分与其蛋白质目标结合产生的空间位阻可以保护末端与小分子相连的单链DNA(ssDNA)。这种小分子DNA的末端保护检测策略操作简单、不受DNA序列编码的限制，与DNA信号放大检测策略相结合，可使得末端标记有与蛋白质结合的小分子的DNA链成为检测这些蛋白质的理想选择。富G碱基的DNA序列可以在Na+、K+、小分子或某些阳离子染料的诱导下折叠成高度有序的G-四链体或G-三链体结构，可以与荧光染料如硫黄素T(ThT)结合发出增强的荧光信号，在构建荧光生物传感器方面有着极其广泛的应用。Y型三向结构由于其结构简单、稳定性高等优异的性能，还能方便地用于与目标DNA的特异性识别，因此在许多信号放大领域具有巨大的应用潜力。本论文主要利用G-四链体、G-三链体与荧光染料ThT结合所发出光谱的特性以及ExoIII辅助下基于Y型三向结构的DNA信号扩增策略来构建一系列生物传感器以检测链霉亲和素(SA)、目标DNA链、K-ras基因和HBVDNA，主要研究内容可以分为以下三个部分： （1）基于小分子DNA的末端保护高灵敏检测链霉亲和素。SA存在时，SA与LDNA3’末端上的小分子生物素结合，保护了ExoIII对双链DNA中LDNA的水解消化，且在ExoIII对ADNA的消化下LDNA被释放出来，并在与HPA的识别区域的结合后形成Y型三向结构以触发ExoIII辅助的循环扩增，释放大量富G序列，富G序列在ThT的诱导下折叠形成G-四链体结构并发出强的荧光信号。实验结果显示，SA的浓度在0.005-2000ng/mL的范围内体系荧光差值与SA浓度的对数值呈线性关系，检出限为0.002ng/mL，且在1%血清样品中呈现出与缓冲液中相似的线性关系。 （2）基于核酸外切酶III辅助双循环信号放大的通用无标记超灵敏检测DNA。目标DNA存在时，目标DNA与MB形成Y型三向结构并触发ExoIII辅助的循环扩增释放目标DNA和一个富G的触发链TG，在ExoIII辅助下TG可以触发与HPB的链置换循环释放另一个富G序列HPBG，TG和HPBG在ThT的诱导下折叠形成G-四链体结构并发出强的荧光信号。实验结果显示，目标DNA的浓度在20fM-2nM的范围内体系荧光差值与目标DNA浓度的对数值呈出两段线性关系，其检出限为15fM；K-ras基因的浓度在200fM-20nM的范围内体系荧光差值与K-ras浓度的对数值呈线性关系，其检出限为88fM，且K-ras基因在0.5%血清样品中的加标回收率为93.40％~108.1％。 （3）基于Y型三向结构的多重信号放大策略检测HBVDNA。当HBVDNA存在时，HBV与HP结合形成Y型三向结构并触发ExoIII辅助的循环扩增释放HBV和与HBV有着相同触发作用的T片段，而HBV和T片段均可以与PC形成Y型三向结构并触发ExoIII辅助的循环扩增，经过这样多重循环，大量锁在PC发夹茎部的富G序列被释放出来，并在ThT的诱导下折叠形成G-四链体结构并发出强的荧光信号。实验结果表示，HBV的浓度在50fM-500pM范围内体系荧光差值与HBV浓度的对数值呈线性关系，其检出限为33fM，且在0.5%血清样品中的加标回收率为94％~101.8％。
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