摘要
研究背景蒙医药是我国民族传统医学中重要的一部分，是蒙古族人民在长久的生产生活中积累总结的智慧结晶。蒙药珍宝丸由29味天然药材配伍而成，临床研究证实了珍宝丸对急性脑缺血后神经保护和功能恢复的治疗效果，但珍宝丸对血管内皮细胞是否具有保护作用尚不清晰。自噬是正常细胞内存在的自我清除机制，生理条件下，自噬体负责囊括衰老、发生错误折叠的蛋白质及受损的细胞器等，与溶酶体结合利用酸性环境将囊括的物质降解再利用的过程，在维持细胞内环境稳态和生存方面发挥重要作用。随着国内外学者对缺血再灌注、心脑血管缺血缺氧疾病等方面的深入研究，发现在缺血再灌注损伤过程中自噬可能是一种新的、有效的保护机制，但是自噬如何参与脑缺血再灌注损伤的病理生理变化存在争议。因此，研究珍宝丸保护机制与自噬的关系对于探讨珍宝丸药物作用靶点来说十分重要。目的珍宝丸是否对血管内皮细胞具有保护作用尚不清楚，本研究利用H2O2建立人脐静脉内皮细胞（HUVEC）氧化应激体外模型，探讨珍宝丸保护作用与自噬的关系及作用机制。方法第一部分：首先将SD大鼠随机分为低剂量（0.25g/kg）组、中剂量（0.5g/kg）组、高剂量（1.0g/kg）组和空白（溶剂1%CMC-Na）组，珍宝丸连续灌胃7天，最后一次灌胃1h后取血，制备珍宝丸含药血清及空白血清（不含药大鼠血清）。1.CCK-8法检测不同H2O2浓度（100μM、200μM、400μM、800μM）对细胞活性的影响。2.CCK-8法筛选不同珍宝丸灌胃浓度（0.25g/kg、0.5g/kg、1.0g/kg）含药血清对HUVEC细胞的保护作用。3.根据前述实验得到的H2O2诱导浓度和珍宝丸含药血清浓度，将细胞分为正常对照组、H2O2组、H2O2+空白血清组、H2O2+珍宝丸组，探讨珍宝丸对HUVEC氧化应激损伤的保护作用：利用Annexinv-FITC/PI双染法流式检测各组细胞凋亡水平；采用荧光探针DCFH-DA检测各组细胞的活性氧（ROS）产生水平；利用乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒检测各组细胞LDH水平；利用罗丹明-123检测各组细胞线粒体跨膜电位（MMP）水平；第二部分：在第一部分组别的基础上增加H2O2+珍宝丸+3-MA（自噬抑制剂）组。1.利用GFP-mCherry-LC3腺病毒感染细胞，共聚焦显微镜下观察荧光强度即自噬水平。2.电镜下观察各组细胞的自噬体数量。3.利用Annexinv-FITC/PI双染法检测各组细胞凋亡情况。4.qPCR技术检测HUVEC细胞自噬相关基因Beclin-1、LC3和凋亡相关基因Bcl-2、Bax的mRNA表达量。5.Westernblot方法检测HUVEC细胞Beclin-1、LC3、Bcl-2、Bax及自噬相关通路Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白的表达情况。结果第一部分：1.CCK-8结果显示，400μMH2O2作用细胞2h，细胞活性显著性下降（P＜0.01），确定为建立HUVEC氧化应激模型的损伤条件。2.0.5g/kg珍宝丸含药血清将HUVEC细胞活力恢复至最高（P＜0.01），确立为后续实验条件。3.与H2O2组相比，H2O2+珍宝丸组能够显著降低细胞凋亡水平（P＜0.05）、LDH水平（P＜0.01）、ROS产生（P＜0.05），维持MMP水平（P＜0.01）。第二部分：1.共聚焦显微镜下观察自噬水平，与正常对照组相比，H2O2组、H2O2+空白血清组LC3荧光明显增强；与H2O2组相比，H2O2+珍宝丸组、H2O2+珍宝丸+3-MA组的LC3荧光均明显减弱。2.电镜下观察自噬体数量，与正常对照组相比，H2O2组、H2O2+空白血清组典型自噬体数量明显增多；与H2O2组相比，H2O2+珍宝丸组、H2O2+珍宝丸+3-MA组自噬体数量明显减少。3.H2O2+珍宝丸+3-MA组与H2O2+珍宝丸组相比，凋亡率进一步降低（P＜0.05）。4.与H2O2组比较，H2O2+珍宝丸组Beclin-1、LC3mRNA表达受到抑制（P＜0.01），BaxmRNA表达降低（P＜0.05），Bcl-2mRNA表达增强（P＜0.01）；与H2O2组+珍宝丸相比，H2O2+珍宝丸+3-MA组促进Bcl-2mRNA表达（P＜0.01），抑制BaxmRNA表达（P＜0.05）。5.与H2O2组相比，H2O2+珍宝丸组Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白高表达被抑制（P＜0.01），Bcl-2表达增强（P＜0.01），Bax蛋白表达减少（P＜0.01）；与H2O2+珍宝丸组比较，H2O2+珍宝丸+3-MA组Bax蛋白进一步被抑制（P＜0.05），Bcl-2表达进一步增强，但无统计学意义。6.与H2O2组相比，H2O2+珍宝丸组p-Akt表达增加（P＜0.01），p-mTOR蛋白表达增强（P＜0.05）。结论珍宝丸能够对抗H2O2诱导的HUVEC氧化应激损伤，珍宝丸可能通过抗凋亡和抗自噬作用为血管内皮细胞提供抗氧化应激损伤保护作用，并且可能是通过激活PI3K/Akt/mTOR通路及其上下游来发挥作用。以往未有通过此角度探索珍宝丸对脑缺血再灌注损伤的保护作用，我们的研究结果为珍宝丸作用靶点研究提供了新思路。
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