摘要
目的 基于病证结合理论，以中医外科疮疡半阴半阳证之代表方-冲和膏为实验研究方剂，探究其对糖尿病溃疡半阴半阳证血管新生的作用机制。 方法 本课题由两部分实验组成： 1.实验一：基于病证结合理论，采用糖尿病溃疡动物模型建立方法结合苦寒泻下方剂番泻叶颗粒灌胃建立糖尿病溃疡半阴半阳证动物模型。并设立目前认可的糖尿病溃疡阳证和糖尿病溃疡阴证动物模型组相对照，采集大鼠宏观表征信息后根据量表打分，结合现代医学微观指标，加以实验二半阴半阳证代表方冲和膏疗效反证，评价模型成立。 2.实验二：将180只Wistar大鼠，分为正常组（Z组）、模型组（M组）、冲和膏组（C组）、金黄膏组（J组）、回阳玉龙膏组（H组）、红霉素软膏组（X组）6个组，每组30只。除正常组外，其余各组建立糖尿病溃疡半阴半阳证模型，各治疗组给予相应的药物外敷，每日上、下午各换药一次，灭菌三伏贴箍围固定。于用药第1、3、7、14、21天创面清创后使用数码相机取固定焦距、像素，垂直于伤口拍摄带标尺的伤口图片，采集到的图片采用NIHImageJ1.48软件测量伤口面积，计算创面愈合率。大鼠创面组织取材后HE染色进行病理组织学观察，Masson染色评价创面愈合中胶原纤维生成情况，免疫组化染色检测CD31、MPO、CD163、CD68表达情况，评价血管内皮细胞、中性粒细胞、巨噬细胞在治疗过程中的变化情况，Westernblot法检测VEGF、VEGFR1表达情况，观察促血管生成细胞因子及其受体的变化情况，RT-PCR检测miR-126、PIK3R2基因表达量，从分子生物学角度评价血管生成相关基因表达情况。 结果： 实验一： 1.“腹腔注射STZ-皮肤缺损-金黄色葡萄球菌感染-苦寒泻下方剂灌胃”复合因素造模方法可以建立糖尿病溃疡半阴半阳证动物模型，宏观辨证基本符合病证特点。 2.创面愈合率：糖尿病溃疡半阴半阳证组与糖尿病溃疡阳证组差异无统计学意义（P＞0.05），与糖尿病溃疡阴证组差异有统计学意义（P＜0.05）。 3.免疫组化CD31微血管密度统计结果：糖尿病溃疡半阴半阳证组CD31微血管密度低于糖尿病溃疡阳证组，差异有统计学意义（P＜0.05），与糖尿病溃疡阴证组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。 实验二： 1.大鼠一般情况：正常组大鼠毛色白有光泽，饮水量、进食量、活动正常。其余各组大鼠饮水量高于正常组，尿量多，垫料2-3天即需要更换。模型组大鼠毛色白稍发黄且无光泽，尾冷，蜷卧，活动度低，创面愈合缓慢，整体状态较差。冲和膏、金黄膏组相对模型组整体状态较好，其中冲和膏组创面愈合最快，红霉素软膏组次之，但红霉素软膏组大鼠创面有脓毒内陷的情况，整体状态不如冲和膏、金黄膏组。 2.创面愈合率：冲和膏组创面愈合时间最短，用药第7、21天创面愈合率最高，与模型组、金黄膏、回阳玉龙膏、红霉素软膏组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。 3.HE、Masson染色结果：正常组皮肤结构正常，胶原纤维排列有序，未见明显病理变化。模型组皮肤结构损伤严重，与冲和膏、金黄膏、红霉素软膏组相比炎性细胞浸润时间长，新生血管少，再上皮化时间长。第3天，冲和膏组表皮、真皮损伤区域开始结痂，各组有大量炎性细胞浸润，胶原纤维损伤严重，排列散乱无章，差异不明显；第7天，冲和膏组镜下可见大量垂直创面生长的新生血管，胶原纤维排列整齐规律，含量较第3天增多，其余各组胶原纤维排列布局紊乱，金黄膏组表皮层与真皮层剥离，持续发生水肿和炎症，伴有出血红细胞。红霉素软膏组细胞水肿严重；第14天，冲和膏组表皮修复最好，基本完成再上皮化，新生血管数量减少，炎性浸润减轻，形成相对粗大的胶原纤维束且排列规则，金黄膏组生成病理性瘢痕组织，表皮层可见出血后血液凝固，其余各组肉芽组织仍在成熟，胶原纤维开始有序排列；第21天，冲和膏组皮肤结构正常，胶原纤维修复良好，金黄膏组形成致密瘢痕组织，其余三组胶原纤维还未完全成熟。整体而言，冲和膏组皮肤组织修复情况最好，再上皮化时间最短。 4.免疫组化CD31微血管密度、MPO累积光密度值、CD163阳性细胞计数统计结果：正常组CD31、CD163、MPO免疫组化染色为阴性；第7天，冲和膏组CD31微血管密度高于模型组、金黄膏、回阳玉龙膏、红霉素软膏组，差异有统计学意义（P＜0.05）；第7天，冲和膏组MPO表达低于模型组、金黄膏、红霉素软膏组，差异有统计学意义（P＜0.05），与回阳玉龙膏组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；第3、7天，冲和膏组CD163阳性细胞数高于模型组、金黄膏、回阳玉龙膏、红霉素软膏组，差异有统计学意义（P＜0.05）。 5.Westernblot法检测VEGF、VEGFR1蛋白表达：第3天，冲和膏组VEGF表达高于其余各组，差异有统计学意义（P＜0.05），VEGFR1表达低于红霉素软膏组，高于正常组、模型组、金黄膏组、回阳玉龙膏组，差异有统计学意义（P＜0.05）；第7天，冲和膏组VEGF、VEGFR1表达高于其他各组，差异有统计学意义（P＜0.05）。 6.RT-PCR检测miR-126、PIK3R2基因表达：冲和膏组miR-126表达高于其他组，PIK3R2基因表达低于其他组，差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论： 实验一：“腹腔注射STZ-皮肤缺损-金黄色葡萄球菌感染-苦寒泻下方剂灌胃”复合因素造模方法可以模拟临床阳证疮疡失治误治转为半阴半阳证，疮面局部辨证符合糖尿病溃疡半阴半阳证特点。 实验二：冲和膏可能通过上调miR-126，抑制靶基因PIK3R2表达，激活VEGF/VEGFR信号通路增强VEGF表达，促进血管生成。
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