摘要
目的：作为细胞间的“信使”，外泌体通过介导细胞间通信、传递细胞间大分子物质在参与促肿瘤微环境及肿瘤生物学进程中发挥重要作用，其内携带的长链非编码RNA(Longnon-codingRNA,lincRNA)在肿瘤的发生、发展及肿瘤转移微环境中发挥重要作用。为进一步探讨其功能和生物学机制，本研究于外周血清及细胞培养基中提取外泌体，检测外泌体中Z38基因的表达；并通过干扰及过表达该基因，来研究该基因对胃癌SGC7901细胞的生物学影响，及沉默和过表达Z38基因后，STK15、MMP-9mRN及蛋白的表达，为后期胃癌及胃癌肝转移的生物治疗奠定基础。方法：提取人胃粘膜上皮GES-1细胞及胃癌SGC7901细胞培养基、胃正常及胃癌肝转移患者外周血清中的外泌体，采用RT-PCR法检测Z38基因的表达。构建Z38过表达质粒、设计siRNA，利用阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）转染对数期胃癌SGC7901细胞，将细胞分为空白组（不做任何处理）、阴性对照组（转染无关干扰）、沉默组（转染Z38干扰片段）、过表达组（转染Z38过表达质粒），转染48h后在激光共聚焦显微镜下观察细胞转染效率，并提取细胞总RNA和总蛋白，通过实时荧光定量PCR和Western-blot法来检测SGC7901细胞中STK15、MMP-9mRNA及蛋白的表达；将SGC7901细胞种于六孔板中，采用CCK8、划痕实验检测沉默与过表达Z38基因后，胃癌SGC7901细胞的增殖活性和迁移能力的变化；采用细胞流式技术检测经过表达及沉默Z38基因后各组细胞周期及凋亡情况。结果：(1)成功提取外周血清及培养基中的外泌体，并验证Z38基因在胃癌SGC7901细胞培养基及胃癌肝转移患者外周血清外泌体中高表达；(2)PEI转染SGC7901细胞48h后，沉默组细胞可见红色荧光、过表达组SGC7901细胞可见绿色荧光，明场下细胞死亡数少，mRNA水平验证Z38基因能够被成功干扰及过表达；(3)经siRNA沉默，Z38基因的mRNA下调量分别为siRNA-1：38.0%、siRNA-2：64.0%、、siRNA-3：14.1%，siRNA-2组转染效率明显高于siRNA-1、siRNA-3组，siRNA-2的沉默效果最为显著（P＜0.01）；过表达组SGC7901细胞在转染48h后镜下可见明显绿色荧光，结合实时荧光定量PCR结果显示，较阴性对照组，过表达组Z38的mRNA表达水平显著增高，具有显著差异（P＜0.01）。Western-blot结果显示，沉默组STK15蛋白较阴性对照组显著降低（p＜0.05），而过表达组STK15蛋白表达显著升高（p＜0.01）；沉默组MMP-9蛋白表达显著降低（p＜0.01），过表达组MMP-9蛋白表达显著升高（p＜0.01）；(4)划痕结果显示：沉默组细胞的迁移能力较阴性对照组受到抑制（p＜0.05），而过表达组细胞的迁移能力较阴性对照组显著增强（p＜0.05）；(5)CCK8实验结果显示：较阴性对照组，沉默组SGC7901细胞活力明显降低（p＜0.05），而过表达组SGC7901细胞活力显著增强（p＜0.05）；(6)细胞流式结果显示：较阴性对照，沉默组细胞S期、G2/M期中细胞数量明显减少（p＜0.05），表明沉默组细胞主要在S期受到抑制，阻断细胞由S期向G2/M期的进程；沉默组凋亡率较阴性对照组显著上调，过表达组的平均凋亡率下调，差异均具有统计学意义（p＜0.01）。结论：(1)转染Z38过表达质粒显著提高了Z38的mRNA表达量、转染siRNA降低了Z38mRNA的表达，结合显微镜下观察到绿色荧光及红色荧光，说明成功转染了pLVX-EFIa-IRES-GFP-Z38质粒及siRNA，成功使人胃癌SGC7901细胞实现Z38基因的过表达及沉默。(2)划痕、CCK8及细胞流式结果证明Z38作为癌基因能够促进SGC7901细胞的迁移、增强增殖活性、抑制胃癌细胞凋亡；反之，沉默Z38基因的表达可以抑制SGC7901细胞活性、抑制迁移、促进胃癌细胞凋亡。(3)周期结果显示沉默Z38基因阻断了细胞由S期向G2/M期的转换，从而阻滞胃癌细胞的有丝分裂。(4)沉默SGC7901胃癌细胞Z38基因的表达，STK15、MMP-9的mRNA水平及蛋白水平下调，而过表达Z38基因的表达，STK15、MMP-9的mRNA水平及蛋白水平上调，说明通过沉默Z38可以抑制STK15、MMP-9的表达，lincRNAZ38可能通过调控STK15、MMP-9的表达实现抗肿瘤的作用，抑制胃癌转移进程。
NETL