摘要
细胞骨架是细胞功能的基础，微管是细胞骨架的重要组成部分。微管是由α微管蛋白和β微管蛋白组成的异源二聚体形成的管状结构，在哺乳动物体内α微管蛋白和β微管蛋白分别都有多个亚型。现有研究发现小鼠体内至少有7个α微管蛋白亚型，这些亚型在核苷酸序列以及氨基酸序列上具有极高的相似性，目前只有极个别的亚型可以被特异性的抗体所识别，其余亚型均无特异性的抗体，无法对不同微管蛋白亚型在小鼠体内的分布进行时间和空间的定位。因此，不断发展新的方法区分不同的微管蛋白亚型是十分必要的。 孤雄单倍体干细胞是一种可以不断增殖的人造精子，便于快速地进行基因组编辑。我们通过CRISPR/Cas9基因编辑系统对孤雄单倍体细胞进行了基因组编辑，插入荧光蛋白标签标记不同的α微管蛋白亚型，再注射到卵母细胞中，构建荧光蛋白标记的不同α微管蛋白亚型小鼠。通过这一方法，测序结果和蛋白质免疫印迹显示我们成功地构建了7个品系的小鼠，包括EGFP-TUBA1A、mCherry-TUBA1C、EGFP-TUBA3A、mCherry-TUBA3B、EGFP-TUBA4A、EGFP-TUBA8和EGFP-TUBA1A/mCherry-TUBA1C。 我们在成年标签小鼠上检测了6种α微管蛋白亚型的组织表达谱。蛋白质免疫印迹显示，不同亚型的α微管蛋白在不同组织之间表达丰度差异较大。EGFP-TUBA1A主要在神经系统表达，其它组织较少或者未检测到。mCherry-TUBA1C高表达于非神经系统。EGFP-TUBA3A和mCherry-TUBA3B主要表达于生殖系统，其它组织几乎没有表达。EGFP-TUBA4A表达比较广泛，在神经系统表达相对较高。EGFP-TUBA8主要表达于小脑和心脏，嗅觉系统和胃中有少部分表达，其它组织未检测到。 在神经系统中，微管对于神经元发育、形态维持和物质运输十分重要，不同微管蛋白亚型的点突变可以导致神经系统疾病。我们主要对4种α微管蛋白亚型在神经系统的分布特征和在发育过程中的变化进行了研究。首先，免疫印迹结果显示EGFP-TUBA1A蛋白在同形皮质、嗅觉区域、脊髓和背根神经节的发育过程中逐渐下调。免疫组织化学染色显示，神经系统中脑和脊髓广泛表达EGFP-TUBA1A，其中大部分结构中不具有明显的细胞类型特异性，但在部分区域高表达，包括嗅球的僧帽细胞、嗅觉区域中的背茎区神经元、同形皮质5层锥体神经元、海马结构下托中的锥体神经元等。EGFP-TUBA1A在视网膜中表达于视神经节细胞和内网织层几乎所有的神经元，在背根神经节中也主要表达于神经元。其次，免疫组织化学染色显示，mCherry-TUBA1C在神经系统发育早期主要表达在脑室区/脑室下区的神经前体细胞中，成年小鼠mCherry-TUBA1C在脑、脊髓和背根神经节中表达于胶质细胞以及脉络丛上的细胞，在视网膜中分散地表达于部分视神经节细胞层、内网织层和外网层的部分神经元，在主嗅球的嗅神经束层具有较强的信号。第三，TUBA4A在神经系统发育早期表达水平相对较低，在发育过程中逐渐增加。免疫组织化学染色显示，EGFP-TUBA4A广泛表达于脑中不同区域的神经元，并且在部分细胞的树突中丰度较高，比如嗅球的僧帽细胞和同形皮质5层的大锥体细胞等，EGFP-TUBA4A也表达在脊髓灰质、视网膜视神经节和背根神经节的部分神经元。最后，TUBA8在神经系统发育早期表达水平低，出生后逐渐增加。免疫组织化学染色显示，成年小鼠的嗅球、皮层、丘脑的背腹侧复合物和脑干耳蜗核的部分神经元以及海马的锥体细胞层和小脑的浦肯野细胞中高表达EGFP-TUBA8，在P7小鼠的小脑神经元浦肯野细胞的胞体、树突和轴突都有EGFP-TUBA8的存在。 综上所述，我们对孤雄单倍体干细胞进行了基因编辑，成功构建了6个α微管蛋白亚型的7种标签小鼠，筛选了4种表达于神经系统的α微管蛋白亚型，对它们在神经系统的分布特征和在发育过程中的表达变化进行了研究。发现4种α微管蛋白亚型在神经系统中不同区域和细胞类型中的分布以及互补性，确定了它们在神经系统发育过程中的表达变化。该研究为不同α微管蛋白亚型在神经系统中的功能研究奠定了基础，也为同家族高度同源性的不同亚型研究提供了可供借鉴的小鼠模型研究方法。
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