精准型胞嘧啶碱基编辑器的构建与应用

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中文摘要：由CRISPR/Cas9与胞嘧啶脱氨酶结合构成的胞嘧啶碱基编辑器(cytosinebaseeditor，CBE)，可在靶向位点实现C（胞嘧啶）-T（胸腺嘧啶）的碱基转换，碱基编辑器已在多个物种中进行有效的碱基编辑，拥有巨大的临床应用潜力。由于碱基编辑器不会直接诱导产生DNA双链断裂，理论上可以避免由非同源末端连接修复引发的非目的性核苷酸插入与缺失(indel)。然而在碱基编辑器3(BE3)的实际应用中，我们不仅能够检测到非目的性的indel，还能检测到非C-T的碱基颠换（C-A（腺嘌呤）/C-G（鸟嘌呤））。这些非目的性的indel和C-A/C-G的碱基颠换降低了碱基编辑器的编辑产物纯度和精准性。除此之外，近期有研究表明碱基编辑器可在全基因组和转录组范围内诱发严重的脱靶效应。值得注意的是，这些脱靶位点并不是与sgRNA序列相似的位点，且这些脱靶突变随机分布、难以预测。这些缺陷都阻碍了碱基编辑系统在临床治疗等方面的应用。在这篇论文中，通过对BE3引发非目的性indel和C-A/C-G碱基颠换的潜在机制探索，发现尿嘧啶糖苷酶抑制剂是BE3获得高效率高纯度编辑的关键。随后通过反式共表达游离的尿嘧啶糖苷酶抑制剂构建了增强型碱基编辑器(enhancedbaseeditor，eBE)。eBE不仅抑制了非目的性indel和C-A/C-G碱基颠换的产生，同时还提高了C-T碱基编辑效率，因此eBE能够实现产物纯度更高的精准碱基编辑。针对碱基编辑器产生的sgRNA/Cas9非依赖性脱靶效应，首先利用表达两个正交且同源Cas9的方法构建了一种可以定量检测碱基编辑器由APOBEC造成的sgRNA/Cas9非依赖性脱靶效应的方法—CESSCO（co-expressing(S).aureusand(S).pyogenes(C)as9(o)rthologs）。接着，筛选并鉴定了一些胞嘧啶脱氨酶抑制(deoxycytidinedeaminaseinhibitor，dCDI)结构域，并且利用来自小鼠的mA3dCDI结构域和split-TEV系统构建了一种全新的变形式碱基编辑器(transformerbaseeditor,tBE)。在脱靶位点处由于mA3dCDI结构域的共价连接，tBE保持无活性状态。而在靶向位点，tBE通过招募TEV蛋白酶重组切除mA3dCDI结构域，将tBE由无活性状态转化为激活状态，完成碱基编辑。tBE不但能在靶向位点实现高效的C-T碱基编辑，而且利用CESSCO在sgRNA/Cas9非依赖性的单链DNA脱靶位点(single-strandedoff-targetregion，OTssregion)处并没有检测到tBE诱导产生的脱靶突变。结合全基因组和转录组测序证实tBE在全基因组和转录组范围内也只产生背景水平的脱靶突变。综上所述，该论文中构建的eBE和tBE分别成功降低了碱基编辑系统的非目的性indel和C-A/C-G碱基颠换以及脱靶效应，同时促进了高效的C-T碱基编辑，提高了碱基编辑系统的效率、精准性和产物纯度，为碱基编辑系统今后在基础研究和临床治疗等多方面的应用打下了坚实的基础。

作者：

王丽洁

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关键词：

胞嘧啶碱基编辑器 indel C-A/C-G碱基颠换脱靶效应 C-T碱基编辑

授予学位：

博士

学科专业：

生物化学与分子生物学

导师：

陈佳

学位年度：

2020

学位授予单位：

中国科学院大学

语种：

中文

中图分类号：