摘要
背景:严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引发的2019冠状病毒病(COVID-19)在全球范围内大流行，截至2021年4月已造成全球超285万人死亡。因此针对SARS-CoV-2的药物研发刻不容缓。疫苗、小分子药物、中和抗体等均是有效的预防和治疗策略。现阶段，中和抗体作为应对该流行性疾病的有效手段之一，获得了越来越多的关注。SARS-CoV-2病毒表面的刺突(spike)蛋白与宿主细胞上的血管紧张素转化酶2(ACE2)受体相互作用是病毒进入宿主细胞的关键步骤。目前各种研究均表明中和抗体通过靶向特定表位阻断spike蛋白和ACE2的结合从而对COVID-19起到治疗作用。 SARS-CoV-2作为一种RNA病毒，在全球大范围的传播过程中，其spike蛋白序列变异也异常频繁。现阶段高传播性的D614G突变株已经成为主要流行株。除此之外，在英国、南非等地出现了多种新型突变株，这表明仅仅针对spike单一靶点的抗体存在耐药风险，因此，开发广谱抗病毒治疗手段尤为重要。 现阶段研究表明目前各种病毒突变株依旧以细胞表面ACE2作为入侵的靶点，高致病高传播的SARS-CoV-2突变株的spike蛋白突变体均对ACE2蛋白的结合有着不同程度的提高。除此之外，人易感的冠状病毒中，严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)也是以ACE2作为受体侵染宿主细胞。因此开发靶向ACE2的中和病毒侵染的抗体，可能可以有效抑制SARS-CoV-2、SARS-CoV-2突变株、SARS-CoV和HCoV-NL63感染细胞，达到广谱抗病毒目的。然而，ACE2作为正常组织细胞表面抗原，维持肾素-血管紧张素(RAS)系统稳态，起到降血压和保护心脏的作用。所以我们希望获取的单克隆抗体具有足够的安全性，即在不影响ACE2的酶活生理功能的前提下，能特异性靶向ACE2抑制SARS-CoV-2病毒侵染。 目的:我们希望获取靶向人ACE2(hACE2)的单克隆抗体，能在不影响ACE2功能的同时发挥抗SARS-CoV-2病毒的活性。 方法:抗体的制备:通过杂交瘤的方法获得候选抗体分子，并构建成IgG4亚型的人鼠嵌合抗体。在哺乳动物表达系统中表达后，使用亲和层析纯化获得抗体;聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和尺寸排阻色谱法(SEC-HPLC)用于测定蛋白的纯度;60℃加速试验用于检测抗体的热稳定性和聚集情况。 抗体亲和/中和能力的确认:在体外检测该抗体的抗病毒活性及广谱性（包括SARS-CoV-2-D614G、SARS-CoV-2、SARS-CoV和HCoV-NL63）。通过酶联免疫吸附法(ELISA)和生物膜干涉技术(BLI)在分子水平检测抗体与ACE2结合的亲和力和平衡解离常数(KD);竞争性ELISA检测抗体对多种冠状病毒的S1/ACE2的阻断活性;通过假病毒中和实验检测抗体对上述4种冠状病毒的假病毒的中和活性;在生物安全三级实验室，通过野生型病毒中和实验检测抗体对SARS-CoV-2的抑制活性;同时，以ACE2酶活实验用于检测抗体对外源性和内源性ACE2的酶催化活性的影响;WesternBlot实验用于检测细胞内ACE2表达量的变化。 体内药效及安全性评价:抗病毒药效评价模型选择委内瑞拉马脑炎复制子颗粒(VEEV)外源递送hACE2的COVID-19小鼠模型;实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测肺组织中SARS-CoV-2的RNA载量;苏木精-伊红(H&E)染色法观察肺组织的病理学病变;选择hACE2敲入(knock-in)C57BL/6小鼠模型进行初步安全性评价，通过体重监测、血液生化分析和主要器官组织形态学检测等方法评价抗体的安全性。 抗体与抗原结合表位进行分析:利用冷冻电镜(Cryo-EM)技术揭示抗体与抗原的具体结合表位。对结合涉及的氨基酸位点进行突变，并检测抗体与ACE2的亲和力是否发生变化，明确抗原-抗体相互作用的关键位点。 结果:1.靶向ACE2单克隆抗体的获得。利用哺乳动物表达系统表达纯化获得了具有活性的ACE2-Fc、ACE2-his、RBD-his和S1-his蛋白;ACE2-Fc免疫后的小鼠血清效价具有ACE2结合能力和阻断S1/ACE2的中和能力;通过杂交瘤筛选得到一个靶向hACE2的人鼠嵌合抗体3E8，该抗体单体纯度为96％;但60℃加热1小时后抗体发生了聚集，表明其热稳定性有待提高;同时，构建并表达了靶向受体结合结构域（RBD）的抗体B38用作阳性对照，同型对照抗体isotype为阴性对照;为了后续实验要求，构建了稳转细胞株HEK293F-ACE2-EGFP，并验证其过表达水平及细胞表面ACE2的活性。 2.靶向ACE2单克隆抗体的表征。1）3E8对ACE2具有高亲和力:分子水平上3E8与ACE2结合的EC50值和KD值分别为15.35nM和30.5nM;细胞水平上可以与表达ACE2的细胞株VeroE6和HEK293F-ACE2-EGFP结合，并呈现出浓度梯度依赖。2）3E8具有广谱抗病毒中和活性:分子水平，3E8可以阻断4种冠状病毒的S1蛋白与ACE2的结合;假病毒水平，3E8可以有效中和4种冠状病毒的假病毒对受体细胞HEK293F-ACE2-EGFP的侵染，中和能力优于ACE2-Fc和B38;实验过程中发现spike末端截短型假病毒感染能力强于全长型假病毒，而3E8对截短型假病毒强感染体系也具有中和效果;对于SARS-CoV-2活病毒，抗体处理后有效抑制其对VeroE6细胞的感染和病毒的复制。3)对ACE2功能的影响:3E8不影响外源性ACE2（ACE2-his蛋白）和内源性ACE2（VeroE6细胞）的酶活催化功能。尽管3E8会介导ACE2发生内吞，但在发挥药效的浓度下，全细胞裂解液中ACE2的表达量并没有明显变化。 3.动物体内药效及安全性评价。在COVID-19小鼠模型中，3E8的治疗可以保护肺部免受病毒感染，肺病毒载量减少约40倍，组织损伤减轻。hACE2敲入小鼠安全性评价中，体重监测和血液生化分析并未发现异常，主要器官未发生生理学病变。证明3E8疗效显著，且具有很好的安全性。 4.抗体与抗原结合表位分析。Cryo-EM解析3E8/ACE2-B0AT1复合物的结构，总分辨率为3.2(A)。ACE2中涉及与3E8相互作用位点为Q18、E23、Q24、F28、K31、H34和Y83。将上述氨基酸进行单点突变后，除F28A外，其余突变体均可以正常表达全长蛋白。进一步结合实验表明:3E8与ACE2的Q18A、E23A、Q24A、K31A以及Y83A突变体的亲和力出现不同程度下降，表明这些位点在抗原-抗体结合过程中确实发挥着重要作用;而His34的多个突变体与抗体的亲和力未发生明显改变，表明His34单突变不足以影响3E8与ACE2的结合能力。 结论:通过本课题研究，我们获得了一个全新的靶向hACE2的单克隆抗体3E8。该抗体可以实现对SARS-CoV-2（野生型和D614G突变型）及其他冠状病毒（SARS-CoV和HCoV-NL63）的中和能力和治疗作用，同时不影响ACE2发挥生理功能，并初步验证了3E8对hACE2敲入小鼠没有明显毒性。综上我们证明了ACE2是有潜力的抗病毒靶点，并提供了一种高效低毒、可用于广谱治疗冠状病毒感染的中和抗体。
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