摘要
光合生物制造技术是以光合自养生物为平台将光能和二氧化碳直接转化为生物燃料和生物基化学品的绿色生物制造模式。蓝细菌作为极具潜力的光合底盘已成为光驱固碳细胞工厂的重要构建平台。拓展蓝细菌的光合代谢网络和提高蓝细菌底盘细胞的耐受性对于促进蓝细菌光合生物制造技术的工程化应用进程具有重要意义。针对光合代谢网络的拓展，本研究首先以最具代表性的糖类物质葡萄糖作为目标产品，结合多组学分析技术和代谢工程改造策略成功构建了高效的蓝细菌光驱固碳合成葡萄糖细胞工厂。针对蓝细菌底盘细胞的耐受性优化，本论文围绕ATP合成酶的扰动开发了多种策略，成功提高了蓝细菌底盘藻株和工程藻株的高温高光耐受性。 针对蓝细菌光合代谢网络的拓展，本研究以生物炼制过程中最重要的糖原料——葡萄糖作为目标产品，设计并构建了光驱固碳合成葡萄糖的蓝细菌细胞工厂。以蓝细菌模式藻株聚球藻PCC7942为平台，发现葡萄糖激酶Glk的敲除将导致葡萄糖的大量合成与分泌。进一步通过多组学和代谢工程改造策略解析了葡萄糖的合成途径，证明胞外积累的葡萄糖主要是来源于胞内被“激活”的蔗糖合成途径。Glk的敲除还会导致PCC7942细胞内大量糖类代谢物丰度上调而大量磷酸化代谢物丰度显著下调。重测序结果显示，Glk缺失菌株中synpcc7942_1161编码的DMT家族转运蛋白发生了V92I点突变，该突变可能调控了葡萄糖的胞外转运过程。通过结合多组学检测与分析、代谢工程改造、培养条件优化等多种策略成功将工程藻株的胞外葡萄糖产量提高到了5.0g/L。 高温高光胁迫会严重抑制蓝细菌光合细胞工厂的生物量积累和产物合成效能，本论文针对蓝细菌的高温高光耐受性进行了系统改造。基于聚球藻PCC7942开发了一种快速、方便且无抗性标签引入的“AtpA-C252F突变快速导入策略”，该策略的使用成功提高了蓝细菌光合合成蔗糖细胞工厂的鲁棒性和蔗糖合成效能。在此基础上，将蓝细菌ATP合成酶的原位定向进化和高温高光表型筛选策略相结合开发了新型ATP合成酶扰动策略，使用该策略发现ATP合成酶编码基因上存在6个特殊的单核苷酸多态性均可显著提高聚球藻PCC7942的高温高光耐受性。针对ATP合成酶上筛选到的高频功能性突变位点进行保守性分析发现AtpA的E166和Q267这两个氨基酸位点在原核生物和叶绿体中均是高度保守性的，且对这两个位点进行饱和突变后发现Q267只有突变成H而E166位点可突变成10种不同的氨基酸来显著提高PCC7942的高温高光耐受性。进一步探究结果证明AtpA突变型抗逆藻株的胞内糖原积累量和ATP含量均有显著提高。此外，对聚球藻PCC7942和集胞藻PCC6803这两种经典模式藻株的ATP合成酶进行了不同亚基的表达丰度调控。结果证明聚球藻PCC7942中过量表达ATP合成酶F1模块的gamma、delta、alpha亚基可以提高藻株的高温高光耐受性，而集胞藻PCC6803中过量表达F1模块的alpha、beta、delta、epsilon亚基以及Fo模块的c亚基可以提高藻株的高温高光耐受性。
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