摘要
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，但病虫害的频繁爆发极大影响了水稻产量。其中，褐飞虱是危害水稻最为严重的害虫，每年对水稻产量构成极大威胁，亟需有效的防治方法。防治褐飞虱的方法中，利用水稻的自身的抗性基因进行育种是目前最为经济有效和环境友好的方法。MicroRNA(miRNA)是一类长度为20-25nt的单链非蛋白编码小分子，它能够通过负调控其靶基因的表达影响植物生长发育、生理代谢和逆境响应。近年来，随着研究的不断深入，miRNA逐渐成为作物遗传改良的强有力选择。然而，miRNA在植物-昆虫互作中的作用及其作用机制还鲜有研究。本文主要介绍了水稻中两个较为保守的miRNA，OsmiR396和OsmiR319，在调控抗褐飞虱中的作用及其分子机理。 为研究miRNA在调控水稻对褐飞虱抗性中的作用，我们对褐飞虱取食前后的水稻进行了miRNA测序分析。结果显示，若干miRNAs在褐飞虱取食后显著上调表达，如:OsmiR396b，OsmiR1861d，OsmiR398b等;同时，也有部分miRNAs在褐飞虱取食后表达明显下降。我们选择对OsmiR396进行深入研究。首先，通过构建一个过表达OsmiR396的靶标类似物OsmiR396targetmimic(MIM396)的方法来阻断OsmiR396的调控作用，对OsmiR396的功能进行研究。在获得的MIM396转基因植株中，所有的OsmiR396s均被下调。然后，小群体和单株抗褐飞虱鉴定结果均显示，MIM396与野生型植株（wildtype，WT）相比更加抗褐飞虱，说明OsmiR396负调控水稻抗褐飞虱。Growthregulatingfactor8(OsGRF8，LOC_Os11g35030)是OsmiR396的一个靶基因，过表达OsGRF8的植株(GRF8OE)呈现抗褐飞虱表型，检测发现MIM396和GRF8OE植株中的类黄酮含量与WT相比都有所增加。通过对39个天然水稻品种中的类黄酮含量测定及褐飞虱取食后的虫增重分析，我们证明了天然水稻植株中类黄酮含量与其抗褐飞虱能力呈正相关。用外源类黄酮处理野生型植株后，植株对褐飞虱的抗性增强，进一步说明类黄酮影响水稻对褐飞虱的抗性。我们通过mRNA水平表达分析、酵母单杂交、ChIP、Dual-LU.C等实验证实OsGRF8蛋白能够直接结合并激活类黄酮合成途径基因flavanone3-hydroxylase(OsF3H，LOC_Os03g03034)的表达，随后的遗传功能分析表明:OsF3H正调控水稻中类黄酮含量和水稻的抗褐飞虱能力。因此，在本研究中，我们提出了一个新的水稻响应褐飞虱取食的防御机制:OsmiR396通过其靶基因OsGRF8编码的蛋白对类黄酮合成途径基因OsF3H进行直接转录激活，参与类黄酮合成，并且发现类黄酮含量与水稻对褐飞虱的抗性成正相关。本研究为miRNA在水稻抗褐飞虱育种中的应用提供了理论指导。 OsmiR319家族极为保守，已有的报道表明:OsmiR319调控植物叶片的发育、耐冷性以及抗病性，尚未发现OsmiR319介导水稻抗褐飞虱的相关研究。通过miRNANorthernblot和QuantitativeReal-timePCR（qRT-PCR）实验，我们证明OsmiR319在褐飞虱取食的水稻茎部表达量较高，说明OsmiR319的表达明显受褐飞虱取食所诱导。水稻中有两个基因编码成熟OsmiR319，分别为OsMIR319a和OsMIR319b，我们分别构建了OsMIR319a和OsMIR319b过表达转基因植株(miR319aOE和miR319bOE)以及阻断OsmiR319功能的转基因植株(MIM319)。抗褐飞虱鉴定结果显示miR319aOE和miR319bOE植株呈现感褐飞虱表型，MIM319植株呈现抗褐飞虱表型。OsPCF5（LOC_Os01g11550）是OsmiR319的一个靶基因，而且，我们也发现OsPCF5同样受褐飞虱取食诱导表达上调，过表达OsPCF5的转基因植株PCF5OE呈现抗褐飞虱表型。在激素处理实验中，我们发现野生型水稻经100μMMeJA(Methyljasmonate)处理后OsmiR319的表达量显著增加，而OsPCF5的变化呈相反趋势。通过一系列生化实验，我们证明OsPCF5能直接结合茉莉酸信号通路的CORONATINEINSENSITIVE1a(OsCoia,LOC_Os01g63420)和JASMONATEZIM-domainfamily4(OsJAZ4,LOC_Os09g23650)的启动子，并负调控二者的表达。通过酵母双杂交实验以及BiFC实验进一步证明:OsPCF5还可以和OsJAZ3和OsJAZ4蛋白发生蛋白互作。我们对OsJAZ4敲除植株(JAZ4CAS9)和COI1RNAi植株进行了单株褐飞虱鉴定，结果显示，COI1RNAi和JAZACAS9都呈现抗褐飞虱表型，即二者都负调控水稻对褐飞虱的抗性。本研究揭示了OsmiR319通过调控茉莉酸信号传导途径的基因，介导水稻对褐飞虱的抗性机理。为研究OsmiR319在水稻响应褐飞虱取食过程中的分子机制提供了理论基础。
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