摘要
双特异抗体由于“双重靶向性”，具有传统单克隆抗体不具备的协同增强或具有全新的生物学功能，有潜力解决单克隆抗体治疗中免疫耐受或响应率低等问题，已成为近年来免疫治疗等领域研究的热点。目前双特异抗体大多基于传统抗体Fab或scFv构建而成，在开发及生产中仍面临一些难题，如重轻链错配、分子量大、结构不稳定等。基于此，本研究利用新型纳米抗体开发设计双特异抗体，探索解决以上难题，为双特异抗体开发及应用奠定基础。现研究成果总结如下: (1)本研究利用PD-L1及CTLA-4抗原作为双靶点免疫羊驼，构建获得免疫效价106及105以上，库容107～108的纳米抗体噬菌体免疫库，库序列差异性达92％以上。通过噬菌体展示技术，筛选获得了9株PD-L1及8株CTLA-4纳米抗体，原核表达产量高达14.37mg/L。 (2)对候选纳米抗体的阻断活性、抗原特异性、亲和力及种属抗原交叉反应性进行测试，最终分别获得5株抗原特异性强，且具亚纳摩尔级亲和力的PD-L1纳米抗体以及4株纳摩尔级亲和力的CTLA-4纳米抗体。所有纳米抗体均具有人-猴种属交叉反应活性，其中1株CTLA-4纳米抗体还具有鼠CTLA-4结合活性，为双特异纳米抗体CTLA-4靶点结合臂候选之一。 (3)利用羊驼IgG2a部分铰链作为linker，连接PD-L1及CTLA-4候选纳米抗体，设计了3种不同格式的“2+2”IgG样-双特异纳米抗体，真核哺乳细胞系统表达产量在207～300mg/L之间，其中构建BsAb-F1型双特异纳米抗体表达产量高达300mg/L，且同单价纳米抗体相比，亲和力提高近10倍，分别在皮摩尔及亚纳摩尔水平，符合预期。表明该分子格式下两靶点结合臂受空间位阻影响较小，具有空间结构优势。另外，BsAb-F1同PD-L1靶点结合KD值与Tecentriq相似;同CTLA-4靶点结合亲和力较Yervoy弱10倍。 (4)经体外细胞功能验证，BsAb-F1同Tecentriq一致，具有PD-L1靶点强阻断（EC500.3880μg/ml）效应;但对CTLA-4靶点阻断效应（EC507.448μg/ml）较弱，约为Yervoy阻断效应的三分之一。另外，BsAb-F1能协同刺激T细胞分泌IFN-γ等细胞因子。 (5)经小鼠药效实验证明，BsAb-F1能显著抑制肿瘤生长，且呈剂量依赖性，与其亲本单抗及市售Tecentriq药物相比，具有更强的抗肿瘤活性。经药物代谢动力学检测，我们发现BsAb-F1在荷瘤小鼠体内药物代谢与传统抗体Tecentriq相似，体内半衰期在3-4天之间，相比其亲本单抗代谢，提高了3-4倍。本研究设计双特异纳米抗体结构具有治疗性抗体所期望的药代时长，具有巨大的应用价值。 综上所述，本研究成功建立了一个双特异纳米抗体技术开发平台，研发出同时靶向PD-L1及CTLA-4的双特异纳米抗体，经体外及体内药效实验验证，具有增强的抗肿瘤功效，应用潜力大。本研究为继续进行其他靶点双特异纳米抗体的研发奠定了基础。
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