摘要
大豆(Glycinemax(L.)Merr.)作为一种重要的经济作物，为人类提供了丰富的蛋白质和油脂来源。随着人们生活水平的提高，我国对大豆的需求日益增强，到目前为止，我国大豆对外依存度超过80％。大豆单产水平较低是我国大豆生产中的一个瓶颈因素。利用杂种优势育种是提高作物单产的重要途径之一，也是提高大豆产量的有效措施之一。目前关于大豆杂种优势利用的研究主要集中在第一代以细胞质雄性不育系为遗传工具的三系法杂交育种技术，而第三代以遗传工程不育系为遗传工具的两系法杂交技术还处于空白状态。本论文拟采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术敲除野生型大豆中影响绒毡层发育的GmAMS基因，获得大豆隐性细胞核雄性不育突变体，并结合SPT(SeedProductionTechnology)技术，创制可应用于商业化制种的稳定的细胞核雄性不育系和保持系，建立第三代大豆杂交育种体系，为进一步提高我国大豆产量提供理论技术基础。目前，具体研究结果如下: 1、大豆GmAMS基因的分离和鉴定 根据拟南芥中AMS基因的蛋白序列，BLAST比对发现在大豆中有两个AMS基因的同源基因，Glyma.10G281800和Glyma.20G107500，与拟南芥AMS的氨基酸序列的同源性分别为60.4％和56.4％，并将其命名为GmAMS1和GmAMS2，二者均属于bHLH-MYC转录因子家族。进化分析表明，GmAMS蛋白与菜豆和绿豆的同源基因的亲缘关系较近。对大豆GmAMS基因的时空表达特异性分析，发现在大豆花蕾的不同发育阶段，GmAMS1的相对表达水平均高于GmAMS2，尤其是在花蕾大小为1.5mm和2mm时，GmAMS1的相对表达水平分别是GmAMS2的20.85倍和17.20倍。 2、大豆GmAMS细胞核雄性不育系的创制 对大豆中的GmAMS基因设计了三个敲除载体，分别为GmAMS1单敲载体，GmAMS2单敲载体以及GmAMS1和GmAMS2双敲载体。通过农杆菌介导的大豆遗传转化后，GmAMS1单敲载体在T0代获得61株转基因植株，其中阳性植株32株:GmAMS2单敲载体在T0代获得52株转基因植株，其中阳性植株21株;GmAMS1和GmAMS2双敲载体在T0代获得66株转基因植株，其中阳性植株30株。在T1代转基因植株中，一共分离得到了8株完全雄性不育突变体植株，其中Gmams1单敲突变体6株，Gmams1，2双敲突变体2株。然而，GmAMS2单敲载体在T2代所获得的Gmams2纯合突变体植株均为可育植株。 对Gmams纯合突变体植株进行表型观察，发现Gmams1单敲突变体和Gmams1，2双敲突变体植株在营养生长时期与野生型没有显著差异，但在生殖生长时期花粉败育，植株呈现出完全雄性不育的表型。而Gmams2单敲突变体植株在生殖生长时期与野生型没有明显差异，均为可育植株。以上结果表明只有GmAMS1基因的突变可以产生雄性不育的表型。 3、大豆Gmams细胞核雄性不育系的绒毡层发育 对Gmams纯合突变体的花药进行细胞学分析，发现GmAMS1基因的突变导致大豆绒毡层发育异常:首先观察到小孢子的初级外壁形态异常，其次是绒毡层的延迟降解最终导致Gmams1突变体的花粉败育，使植株产生完全雄性不育的表型。Gmams1，2双敲突变体花药的发育过程与Gmams1单敲突变体一致，而Gmams2单敲突变体与野生型一致;进一步说明了GmAMS1在调节大豆绒毡层发育过程中起着至关重要的作用。 拟南芥中绒毡层的发育受DYT1-TDF1-AMS-MS1等转录因子的级联调控，分别在野生型和Gmams1突变体中检测了大豆中AMS基因的上游基因TDF1和下游基因MS1的表达情况。TDF1在大豆中一个同源基因Glyma.13G066600在Gmams1突变体中的表达量显著降低，而另一个TDF1同源基因Glyma.19G017900的表达没有发生显著变化;MS1在大豆中的两个同源基因Glyma.01G047400和Glyma.02G107600在Gmams1突变体中的表达均达到极显著降低的水平。 4、基于大豆GmAMS1的SPT保持系的构建 分别克隆了大豆花粉特异启动子GmLAT52和α-淀粉酶基因GmAMY1，成功构建了由花粉特异启动子GmLAT52驱动GmAMY1表达的双元表达载体，作为花粉致死的表达元件，并转入野生型中验证。对T0代阳性植株的花粉进行I2-KI染色发现，由花粉特异性启动子GmLAT52启动子驱动GmAMY1的表达可以使大豆的花粉失活，从而可以确定该表达元件可用于后续构建基于GmAMS1的SPT保持系;分别克隆了大豆种皮特异启动子GmSC和mCherry序列，成功构建了由种皮特异启动子GmSC驱动mCherry表达的双元表达载体，作为种皮筛选的表达元件，并转入野生型中验证;克隆GmAMS1启动子序列和CDS序列，成功构建了由GmAMS1本身启动子驱动GmAMS1表达的双元表达载体，作为育性恢复的表达元件。 同时采用GoldenGate的方法将构建好的育性恢复表达元件、花粉致死表达元件和种皮筛选表达元件组装到一个双元载体中，成功构建了含有三个表达元件的SPT载体，并通过农杆菌介导的大豆遗传转化方法，将该载体转入野生型中。到目前为止，共获得34株转基因植株，其中阳性转基因植株13株。获得的阳性转基因植株将和Gmams1纯合突变体进行杂交，获得基于大豆GmAMS1的SPT保持系。
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