摘要
缺血性脑卒中最有效的治疗策略是及时恢复脑血流灌注。然而，当脑血流恢复灌注时所诱发的CIR损伤一直是临床治疗中的难点。糖尿病状态下，脑细胞因糖脂代谢异常而对缺血和再灌注更加敏感，故当糖尿病患者并发缺血性脑卒中时，其CIR损伤也相应更加严重，治疗也更加困难，且预后更差。因此，阐明糖尿病加重CIR损伤的病理机制以及探究相应的防治策略意义重大，迫在眉睫。 自我保护机制的缺陷和内源性损伤因子的激活是细胞损伤发生最为关键的两个因素。自噬已被多数人认为是细胞重要的自我保护机制。细胞自噬可自我消化和循环利用细胞内受损的细胞器以及异常产生的代谢产物，从而维持细胞内环境的稳态和正常的生理功能。与自噬相反，线粒体损伤被认为是细胞重要的内源性损伤机制。CIR期间，脑组织中因线粒体损伤而使ROS稳态失衡，氧化应激增强，从而加剧神经元损伤和死亡。糖尿病本身可导致脑细胞自噬缺陷和线粒体的损伤，从而进一步加重CIR损伤。 褪黑素易通过血脑屏障，且可发挥显著的神经功能正性调节作用，因而是一种具有广阔应用前景的神经保护候选药物。褪黑素已被证实可在细胞自噬调控和线粒体损伤修复中发挥重要作用。SIRT1-BMAL1信号通路激活以及SIRT3-SOD2信号通路激活介导的神经保护作用已经在非糖尿病模型中得到证实。此外，BMAL1被证明是自噬的正性调控因子可以诱导自噬上调。SOD2作为重要的线粒体基质酶在减轻线粒体氧化性损伤以及维持正常线粒体功能中具有重要作用。因此我们假设，褪黑素有可能通过调控SIRT1-BMAL1信号通路和SIRT3-SOD2信号通路而分别增强自噬调控和减轻线粒体损伤，从而在糖尿病患者CIR期间发挥神经保护作用。 基于以上推测，本论文将在链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病小鼠基础上通过短暂性大脑中动脉栓塞(transientmiddlecerebralarteryocclusion，tMCAO)的方法构建糖尿病和CIR损伤的在体复合模型，将在高糖处理的HT22细胞基础上通过缺氧复氧(hypoxia-reoxygenation,HR)操作模拟糖尿病和CIR损伤的离体复合模型，以此验褪黑素是否通过调控SIRT1-BMAL1信号通路和SIRT3-SOD2信号细胞而分别增强自噬调控和减轻线粒体损伤，从而在糖尿病合并CIR损伤模型中发挥治疗作用。 本论文分如下四部分： 第一部分：糖尿病合并CIR损伤模型中脑细胞自噬和线粒体的病理改变 目的 探究糖尿病合并CIR损伤模型中脑细胞自噬和线粒体的病理改变。 方法 C57BL/6小鼠采用随机数字表法随机分成以下的四组：非糖尿病小鼠进行假手术操作组(NS组)，非糖尿病小鼠进行CIR操作组(NIR组)，糖尿病小鼠进行假手术操作组(DS组)，糖尿病小鼠进行CIR组(DIR组)。糖尿病模型的构建采用腹腔内注射STZ(50mg/kg,5d)。采用tMCAO法制备CIR损伤模型。再灌注24h后对小鼠神经功能缺损情况进行评分，随即处死，收集脑组织进行后续的相关检测。 结果 1.糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠在行CIR后均较相应的假手术组小鼠的脑损伤加重，表现为脑切片病理学染色结果显示出明显的病理学改变(细胞形态不规则，胞浆疏松，有空泡，核固缩、溶解或消失，胞浆尼氏小体皱缩、变性或消失)，以及显著增加的细胞凋亡率(Plt;0.05)。此外，糖尿病组小鼠在行CIR后较相应的非糖尿病组小鼠脑损伤更为严重(Plt;0.05)。 2.非糖尿病小鼠行CIR后自噬上调，表现为LC3II/I的比值以及Beclin1的表达显著增加(Plt;0.05)；而糖尿病组小鼠行CIR后自噬明显下调(Plt;0.05)，且较相应的非糖尿病组小鼠下降更为显著(Plt;0.05)。 3.糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠在行CIR后均较相应的假手术组小鼠的脑组织线粒体损伤明显加重，表现为线粒体出现严重的空泡化和肿胀，Cyt-cytoC表达显著增加以及线粒体ATP生成明显降低(Plt;0.05)。此外，糖尿病组小鼠在行CIR后较相应的非糖尿病组小鼠的脑组织线粒体损伤更为严重(Plt;0.05)。 结论 1.糖尿病可加重CIR损伤；2.糖尿病小鼠CIR损伤加重的机制可能与自噬缺陷和线粒体损伤有关。 第二部分：褪黑素在糖尿病合并CIR损伤模型中对脑细胞自噬缺陷和线粒体损伤的治疗效应 目的 探究褪黑素在糖尿病合并CIR损伤模型中对脑细胞自噬缺陷和线粒体损伤的治疗作用。 方法 动物实验：C57BL/6小鼠随机分成三组：糖尿病小鼠进行假手术操作组(DS组)，糖尿病小鼠进行CIR操作组(DIR组)，糖尿病小鼠进行CIR操作加褪黑素给药组(DIR+Mel)；其中DIR+Mel组根据褪黑素剂量(5mg/kg和10mg/kg)分成两个亚组。再灌注24h后对小鼠的行为学进行评估，随即将其处死，收集脑组织进行后续的相关检测。细胞实验：HT22细胞随机分为三组：将HT22细胞进行高糖处理组(HG组)，将高糖处理的HT22制备HR模型(HHR组)，高糖+HR+褪黑素处理(HHR+Mel组)；其中HHR+Mel组根据不同褪黑素浓度分成三个亚组，分别给予褪黑素25μM，50μM，100μM。复氧24h后收集细胞进行后续的相关检测。 结果 1.与DIR组相比，DIR+5mg/kgMel组和DIR+10mg/kgMel组中褪黑素的使用均显著减小了脑梗死体积以及降低了神经功能缺损评分(Plt;0.05)；与DIR+5mg/kgMel组相比，DIR+10mg/kgMel组脑梗死体积显著减小(Plt;0.05)，神经功能缺损评分改善不明显(Pgt;0.05)。 2.与DS组相比，DIR组脑组织呈现出明显的病理学改变，表现为细胞形态不规则，胞质分布不均，有空泡，细胞周围间隙增宽，核固缩、溶解或消失，胞浆中尼氏小体皱缩、变性或消失；与DIR组相比，DIR+Mel组中上述改变减轻。此外，与DS组相比，DIR组中细胞凋亡率显著增加(Plt;0.05)；与DIR组相比，DIR+Mel组中细胞凋亡率显著降低(Plt;0.05)。 3.与DS组相比，DIR组脑组织细胞自噬水平显著下调，表现为LC3II/LC3I的比值和Beclin1的表达显著降低(Plt;0.05)；与DIR组相比，DIR+Mel组中褪黑素的使用显著削弱了CIR诱导的自噬下调(Plt;0.05) 4.与DS组相比，DIR组脑组织线粒体损伤明显加重，表现为Cyt-cytoC表达显著增加，线粒体ATP生成显著降低(Plt;0.05)；与DIR组相比，DIR+Mel组中褪黑素的使用显著削弱了CIR诱导的线粒体损伤(Plt;0.05)。 5.与HG组相比，HHR组中细胞活力显著降低(Plt;0.05)；与HHR组相比，HHR+Mel组中褪黑素的使用使细胞活力显著改善，且以100μM褪黑素上述细胞保护作用更为显著，并被选做后续实验研究。 6.与HG组相比，HHR组中细胞自噬水平显著下调，表现为LC3II/LC3I的比值和Beclin1的表达显著降低(Plt;0.05)；与HHR组相比，HHR+Mel组中褪黑素的实验显著削弱了HR诱导的自噬下调(Plt;0.05)。 7.与HG组相比，HHR组细胞的线粒体损伤明显加重，Cyt-cytoC表达显著增加，线粒体ATP生成显著降低(Plt;0.05)；与HHR组相比，HHR+Mel组中褪黑素的使用显著削弱了HR诱导的线粒体损伤(Plt;0.05)。 结论 1.褪黑素可在糖尿病合并CIR损伤模型中发挥神经保护作用；2.在糖尿病合并CIR损伤模型中，褪黑素介导的神经保护作用可能与其改善细胞自噬缺陷和减轻线粒体损伤有关。 第三部分：褪黑素在糖尿病合并CIR损伤模型中增强脑细胞自噬的信号通路机制探究 目的 揭示褪黑素在糖尿病合并CIR损伤模型中增强脑细胞自噬的信号通路机制。 方法 C57BL/6小鼠随机分成5组：糖尿病小鼠进行假手术操作组(DS组)，糖尿病小鼠进行CIR组(DIR组)，糖尿病小鼠进行CIR操作加褪黑素给药组(DIR+Mel组)，糖尿病小鼠进行CIR操作并联合使用褪黑素和自噬抑制剂3-MA组(DIR+Mel+3-MA组)，糖尿病小鼠进行CIR操作并联合使用褪黑素和SIRT1抑制剂EX527组(DIR+Mel+EX527组)。再灌注24h后对小鼠神经功能缺损情况评分，随即将其处死，收集脑组织进行后续的相关检测。HT22细胞随机分为5组：常规培养的HT22细胞进行高糖处理组(HG组)，高糖处理的细胞进行HR操作组(HHR组)，高糖处理的细胞进行HR并给予褪黑素组(HHR+Mel组)，高糖处理的细胞进行HR操作并联合给予褪黑素和3-MA组(HHR+Mel+3-MA组)，高糖处理的细胞进行HR操作并联合给予褪黑素和EX527组(HHR+Mel+EX527组)。其中，HHR+Mel组根据不同褪黑素浓度(25μM,50μM,100μM)分成三个亚组。复氧24h后收集细胞进行后续的相关检测。 结果 1.与DS组相比，DIR组小鼠脑组织呈现出明显的病理学改变，表现为细胞形态不规则，胞浆疏松并伴有空泡形成，胞核溶解或消失，胞浆中尼氏小体皱缩、变性甚至消失；与DIR组相比，DIR+Mel组上述改变明显减轻；与DIR+Mel组相比，DIR+Mel+3-MA组脑组织病理学异常明显加重。此外，与DS组相比，DIR组脑组织细胞凋亡率显著增加(Plt;0.05)；与DIR组相比，DIR+Mel组脑组织细胞凋亡率显著降低(Plt;0.05)；与DIR+Mel组相比，DIR+Mel+3-MA组脑组织细胞凋亡率显著增加(Plt;0.05)。 2.与DS组相比，DIR组中氧化应激指标ROS和MDA的水平显著增加，抗氧化应激指标SOD活性显著降低(Plt;0.05)；与DIR组相比，DIR+Mel组中ROS和MDA水平显著降低，SOD活性显著增加(Plt;0.05)；与DIR+Mel组相比，DIR+Mel+3-MA组中ROS和MDA水平显著增加，SOD活性显著降低(Plt;0.05)。 3.与DS组相比，DIR组中LC3II/LC3I的比值以及Beclin1和Atg14表达显著降低(Plt;0.05)；与DIR组相比，DIR+Mel组中LC3II/LC3I的比值及Beclin1和Atg14的表达显著增加(Plt;0.05)；与DIR+Mel组相比，DIR+Mel+EX527组中LC3II/LC3I的比值以及Beclin1和Atg14的表达显著降低(Plt;0.05)。 4.与DS组相比，DIR组中SIRT1和BAML1的表达显著降低，ac-BMAL1的表达显著增加(Plt;0.05)；与DIR组相比，DIR+Mel组中SIRT1和BAML1的表达显著增加，ac-BMAL1的表达显著降低(Plt;0.05)；与DIR+Mel组相比，DIR+Mel+EX527组中SIRT1和BAML1的表达显著降低，ac-BMAL1的表达显著增加(Plt;0.05)。 5.与HG组相比，HHR组细胞凋亡率显著增加(Plt;0.05)；与HHR组相比，HHR+Mel组细胞凋亡率显著降低(Plt;0.05)；与HHR+Mel组相比，HHR+Mel+EX527组和HHR+Mel+3-MA组凋亡率显著增加(Plt;0.05)；与HHR+Mel+EX527组相比，HHR+Mel+3-MA组细胞凋亡率差异无统计学意义(Pgt;0.05)。 6.与HG组相比，HHR组中ROS和MDA的水平显著增加，SOD活性显著降低(Plt;0.05)；与HHR组相比，HHR+Mel组中ROS和MDA水平显著降低，SOD活性显著增加(Plt;0.05)；与HHR+Mel组相比，HHR+Mel+EX527组和HHR+Mel+3-MA组中ROS和MDA水平显著增加，SOD活性显著降低(Plt;0.05)；与HHR+Mel+EX527组相比，HHR+Mel+3-MA组中上述指标差异无统计学意义(Pgt;0.05)。 7.与HG组相比，HHR组中LC3II/LC3I的比值以及Beclin1和Atg14的表达显著降低(Plt;0.05)；与HHR组相比，HHR+Mel组中LC3II/LC3I的比值以及Beclin1和Atg14的表达显著增加(Plt;0.05)；与HHR+Mel组相比，HHR+Mel+EX527组和HHR+Mel+3-MA组中LC3II/LC3I的比值以及Beclin1和Atg14的表达显著降低(Plt;0.05)；与HHR+Mel+EX527组相比，HHR+Mel+3-MA组中上述指标差异无统计学意义(Pgt;0.05)。 8.与HG组相比，HHR组SIRT1和BMAL1的表达明显降低，ac-BMAL1的表达显著增加(Plt;0.05)；与HHR组相比，HHR+25μMMel组SIRT1和BMAL1的表达增加，ac-BMAL1的表达降低，但差异均无统计学意义(Pgt;0.05)，HHR+50μMMel组和HHR+100μMMel组中SIRT1和BMAL1的表达显著增加，ac-BMAL1的表达显著降低(Plt;0.05)；与HHR+25μMMel组相比，HHR+50μMMel组和HHR+100μMMel组中SIRT1和BMAL1的表达显著增加，ac-BMAL1的表达显著降低(Plt;0.05)；与HHR+50μMMel组相比，HHR+100μMMel组中SIRT1和BMAL1的表达增加，ac-BMAL1的表达降低，但差异无统计学意义。 结论 1.在糖尿病合并CIR损伤模型中，SIRT1-BMAL1信号通路被抑制是导致细胞自噬缺陷的信号通路机制；2.在糖尿病合并CIR损伤模型中，褪黑素可通过激活SIRT1-BMAL1信号通路增强细胞自噬而发挥神经保护作用。 第四部分：褪黑素在糖尿病合并CIR损伤模型中减轻脑细胞线粒体损伤的信号通路机制探究 目的 揭示褪黑素在糖尿病合并CIR损伤模型中减轻脑细胞线粒体损伤的信号通路机制。 方法 C57BL/6小鼠随机分成4组：糖尿病小鼠进行假手术操作(DS组)，糖尿病小鼠进行CIR操作(DIR组)，糖尿病小鼠进行CIR操作并注射褪黑素组(DIR+Mel组)，糖尿病小鼠进行CIR并注射褪黑素和SIRT3抑制剂3-TYP组(DIR+Mel+3-TYP组)。再灌注24h后对小鼠的神经功能缺损情况评分，随即将其处死，收集脑组织进行后续的相关检测。HT22细胞随机分为4组：高糖组(HG组)，高糖+HR组(HHR组)，高糖+HR+褪黑素组(HHR+Mel组)，高糖+HR+褪黑素+siSIRT3组(HHR+Mel+siSIRT3组)。复氧24h后收集细胞进行后续的相关检测。 结果 1.与DS组相比，DIR组呈现出明显的病理学改变，表现为细胞形态不规则，胞浆疏松并伴有空泡形成，胞核溶解或消失，胞浆尼氏小体皱缩、变性甚至消失；与DIR组相比，DIR+Mel组中上述改变明显减轻；与DIR+Mel组相比，DIR+Mel+3-TYP组中上述病理学改变明显加重。此外，与DS组相比，DIR组中细胞凋亡率显著增加(Plt;0.05)；与DIR组相比，DIR+Mel组中凋亡率显著降低(Plt;0.05)；与DIR+Mel组相比，DIR+Mel+3-TYP组中凋亡率显著增加(Plt;0.05)。 2.与DS组相比，DIR组中ROS的产生显著增加(Plt;0.05)；与DIR组相比，DIR+Mel组中ROS的产生显著增加(Plt;0.05)；与DIR+Mel组相比，DIR+Mel+3-TYP组中ROS的产生显著降低(Plt;0.05)。此外，与DS组相比，DIR组中线粒体MDA水平显著增加，线粒体SOD活性显著降低(Plt;0.05)；与DIR组相比，DIR+Mel组中线粒体MDA水平显著降低，线粒体SOD活性显著增加(Plt;0.05)；与DIR+Mel组相比，DIR+Mel+3-TYP组中线粒体MDA水平明显增加，线粒体SOD活性显著降低(Plt;0.05)。 3.与DS组相比，DIR组线粒体出现严重空泡化和肿胀；与DIR组相比，DIR+Mel组线粒体空泡化和肿胀明显减轻；与DIR+Mel组相比，DIR+Mel+3-TPY组线粒体空泡化和肿胀明显加重。同时我们的结果显示与DS组相比，DIR组中Cyt-CytoC的表达显著增加，线粒体ATP含量显著减少(Plt;0.05)；与DIR组相比，DIR+Mel组Cyt-CytoC的表达显著降低，线粒体ATP含量显著增加(Plt;0.05)；与DIR+Mel组相比，DIR+Mel+3-TYP组Cyt-CytoC的表达显著增加，线粒体ATP含量显著减少(Plt;0.05)。 4.与DS组相比，DIR组中线粒体生成相关因子NRF1、TFAM的表达显著降低(Plt;0.05)；与DIR组相比，DIR+Mel组中NRFI、TFAM的表达显著增加(Plt;0.05)；与DIR+Mel相比，DIR+Mel+3-TYP组中NRF1、TFAM的表达显著降低(Plt;0.05) 5.与DS组相比，DIR组中SIRT3的表达显著降低，ac-SOD2/SOD2的比值显著升高(Plt;0.05)；与DIR组相比，DIR+Mel组中SIRT3的表达显著升高，ac-SOD2/SOD2的比值显著降低(Plt;0.05)；与HHR+Mel组相比，HHR+Mel+3-TYP组中SIRT3的表达显著降低，ac-SOD2/SOD2的比值显著升高(Plt;0.05)。 6.与HG组相比，HHR组细胞凋亡率显著增加(Plt;0.05)；与HHR组相比，HHR+Mel组细胞凋亡率显著降低(Plt;0.05)；与HHR+Mel组相比，HHR+Mel+siSIRT3组细胞凋亡率显著增加(Plt;0.05)。 7.与HG组相比，HHR组中ROS的产生显著增加(Plt;0.05)；与HHR组相比，HHR+Mel组中ROS的产生显著降低(Plt;0.05)；与HHR+Mel组相比，HHR+Mel+siSIRT3组中ROS的产生显著增加(Plt;0.05)。与HG组相比，HHR组线粒体MDA水平显著增加，线粒体SOD活性显著降低(Plt;0.05)；与HHR相比，HHR+Mel组线粒体MDA水平显著降低，线粒体SOD活性显著增加(Plt;0.05)；与HHR+Mel相比，HHR+Mel+siSIRT3组线粒体MDA水平显著增加，线粒体SOD活性显著降低(Plt;0.05)。 8.与HG组相比，HHR组MMP、ATP的水平显著降低(Plt;0.05)；与HHR组相比，HHR+Mel组MMP、ATP水平显著升高(Plt;0.05)；与HHR+Mel组相比，HHR+Mel+siSIRT3组MMP、ATP水平显著降低(Plt;0.05)。与HG组相比，HHR组Cyt-CytoC表达显著增加(Plt;0.05)；与HHR相比，HHR+Mel组Cyt-CytoC表达显著降低(Plt;0.05)；与HHR+Mel相比，HHR+Mel+siSIRT3组Cyt-CytoC表达显著增加(Plt;0.05)。 9.与HG组相比，HHR组中NRF1和TFAM的表达显著降低(Plt;0.05)；与HHR相比，HHR+Mel组中NRF1和TFAM的表达显著增加(Plt;0.05)；与HHR+Mel相比，HHR+Mel+siSIRT3组中NRF1和TFAM的表达显著降低(Plt;0.05)。 10.与HG组相比，HHR组中SIRT3的表达显著降低，ac-SOD2/SOD2的比值显著升高(Plt;0.05)；与HHR组相比，HHR+Mel组中SIRT3的表达显著升高，ac-SOD2/SOD2的比值显著降低(Plt;0.05)；与HHR+Mel组相比，HHR+Mel+siSIRT3组中SIRT3的表达显著降低，ac-SOD2/SOD2的比值显著升高(Plt;0.05)。 结论 1.在糖尿病合并CIR损伤模型中，SIRT3-SOD2信号通路被抑制是导致线粒体损伤的信号通路机制；2.在糖尿病合并CIR损伤模型中，褪黑素介导的脑保护作用可通过调控SIRT3-SOD2信号通路介导的线粒体保护作用来实现。
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