摘要
牙周炎是一种广泛存在于世界范围内的慢性炎症性疾病，累及并破坏牙周支持组织。牙周炎的发病率高，是目前成年人失牙的主要原因。越来越多的研究证据表明，牙周炎与多种全身系统性疾病密切相关，包括糖尿病、肥胖、心血管疾病及不良妊娠结局等，牙周炎和这类全身疾病形成了一个复杂的相互作用关系网，但这其中潜在的机制尚不明确。 牙周炎的发生和发展与一系列牙周致病菌密切相关，例如牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis,Pg）,其可刺激牙周组织细胞和免疫细胞产生大量促炎因子和蛋白酶等，并最终造成牙槽骨吸收和附着丧失。促炎因子是一类由免疫细胞和巨噬细胞分泌的细胞因子，包括肿瘤坏死因子（Tumornecrosisfactor,TNF）-α、白介素（Interleukin,IL）-1β、IL-6、IL-12、IL-18及干扰素（Interferon,IFN）γ等，这些因子在固有免疫应答调节中具有重要作用。基质金属蛋白酶（Matrixmetalloproteinase,MMPs）能够降解各种细胞外基质蛋白，胞外基质金属蛋白酶诱导因子（ExtracellularMMPsinducer，EMMPRIN）是一种糖基化蛋白，作为细胞外MMPs诱导剂发挥生理作用。大量研究表明，MMPs和EMMPRIN作为促基质降解因子，在牙周炎病程发展中发挥重要作用。 内脂素（Visfatin）是一种脂肪细胞因子，参与糖尿病、肥胖、心血管疾病及癌症等一系列疾病的病理发展。近年来的研究提示，visfatin在牙周炎的发病过程中可能同样发挥着重要的作用，对于visfatin的深入研究将有助于进一步揭示牙周炎的发病机制及其与全身疾病的之间的复杂作用关系。然而目前visfatin与牙周炎的研究少有报道，且大部分研究集中于验证二者的相关性，对于visfatin是否参与牙周细胞炎症反应、visfatin对健康和炎性牙周细胞的调控作用以及潜在的机制尚不清楚。 NF-κB是一种蛋白复合物，在人体内参与多种生理过程，在细胞炎症反应和免疫调节中具有重要地位。此外，不利的生存环境可造成内质网应激，这种情况下细胞会激活未折叠蛋白反应（Unfoldedproteinresponse,UPR）以尝试维持细胞稳态。近年来研究发现，UPR也在细胞炎症反应中发挥了重要作用。UPR是一个复杂的细胞内信号通路的集合，主要包含三个协同作用的通路，其中肌醇需酶（Inositol-requiringenzyme,IRE）1α通路是在进化过程中最为保守的一支。以往有研究表明，NF-κB通路和UPR都与牙周炎进展密切相关，但尚不清楚visfatin是否通过这两个通路在牙周细胞中发挥调控作用。 鉴于此，本研究通过体外分离培养牙周膜细胞（humanperiodontalligamentcells,hPDLCs）和牙龈成纤维细胞（humangingivalfibroblasts,hGFs），利用Pg来源的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）体外模拟炎症微环境，明确visfatin在炎性牙周细胞中的表达变化，探究外源性和内源性visfatin对牙周细胞炎症反应的作用，并尝试探索其中的调控机制。 第一部分：炎症状态下牙周组织和牙周膜细胞中visfatin的表达 实验目的 明确健康个体来源的牙龈组织与牙周炎患者来源的牙龈组织中visfatin的表达与定位；利用PgLPS体外模拟炎症微环境，明确炎性环境下hPDLCs中促炎因子、促基质降解因子和visfatin的表达情况。 材料与方法 1.收集牙周炎患者的炎症牙龈组织，收集行第三磨牙拔除术患者的牙周膜及健康牙龈组织。应用组织块联合酶消化法处理牙周膜，分离并培养hPDLCs。 2.Hamp;E染色验证炎症牙龈组织的炎性状态，免疫组织化学染色检测健康牙龈组织与炎症牙龈组织中visfatin的表达情况。 3.qRT-PCR和westernblot检测不同时长PgLPS刺激下hPDLCs中TNF-α、IL-1β、IL-6和visfatin的表达变化。 4.免疫荧光染色检测不同剂量PgLPS刺激下hPDLCs中TNF-α、IL-1β、EMMPRIN、MMP1和visfatin的表达变化。 实验结果 1.Hamp;E染色结果显示，与健康牙龈组织相比，炎症牙龈组织中上皮破坏明显，炎症细胞浸润明显。免疫组织化学染色结果显示，健康牙龈组织中存在visfatin的表达，主要分布于上皮层，上皮下结缔组织中也有微弱表达；炎症牙龈组织中visfatin表达更强，主要分布于上皮细胞、内皮细胞、hGFs和细胞外间隙。 2.qRT-PCR和westernblot结果表明，hPDLCs经PgLPS刺激后，TNF-α、IL-1β、IL-6和visfatin的mRNA表达水平显著上调；visfatin的蛋白表达水平显著上调。 3.免疫荧光染色结果表明，hPDLCs在PgLPS刺激下，TNF-α、IL-1β、EMMPRIN、MMP1和visfatin的表达显著升高。 结论 1.在炎症牙龈组织中，visfatin的表达水平显著上调； 2.在PgLPS刺激下，hPDLCs中visfatin的表达水平显著上调，同时促炎因子和促基质降解因子的表达水平也明显升高。 第二部分：外源性visfatin调控牙周膜细胞中促炎因子与促基质降解因子的表达 实验目的 研究不同剂量的visfatin重组蛋白对hPDLCs中促炎因子与促基质降解因子表达的影响。 材料与方法 1.用10ng/mL和100ng/mLvisfatin重组蛋白处理hPDLCs，MTS检测细胞活性是否受到影响。 2.用10ng/mL和100ng/mLvisfatin重组蛋白处理hPDLCs3、6、12h。qRT-PCR检测hPDLCs中促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和促基质降解因子（EMMPRIN、MMP1、MMP3、MMP13）的mRNA表达变化。 3.Westernblot检测经visfatin重组蛋白处理的hPDLCs中IL-6和EMMPRIN的蛋白表达变化。 4.ELISA检测经visfatin重组蛋白处理的hPDLCs培养上清中TNF-α、IL-1β和MMP1的分泌蛋白浓度变化。 实验结果 1.10ng/mL和100ng/mLvisfatin重组蛋白刺激不影响hPDLCs的细胞活性。 2.qRT-PCR结果显示100ng/mLvisfatin重组蛋白处理12h后，TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达水平均上调；100ng/mLvisfatin重组蛋白作用6h和12h后，EMMPRIN、MMP1、MMP3和MMP13的mRNA表达水平均上调。 3.Westernblot结果显示，100ng/mLvisfatin重组蛋白处理3、6和12h后，hPDLCs中IL-6和EMMPRIN蛋白的表达水平显著升高。 4.ELISA结果显示，100ng/mLvisfatin重组蛋白处理6h和12h后分别升高了IL-1β和TNF-α的分泌蛋白浓度，MMP1分泌蛋白浓度则在6h和12h均有显著上升。 结论 外源性visfatin重组蛋白促进hPDLCs中促炎因子与促基质降解因子的表达与分泌。 第三部分：内源性visfatin调控牙周膜细胞及炎性牙龈成纤维细胞中促炎因子与促基质降解因子的表达 实验目的 研究内源性visfatin对hPDLCs及炎性hGFs（iGFs）中促炎因子与促基质降解因子表达的影响。 材料与方法 1.使用慢病毒包装系统建立稳定过表达visfatin的hPDLCs细胞系hPDLCs-visfatin及对照细胞。qRT-PCR和westernblot检测过表达visfatin的效果。 2.10μg/mLPgLPS刺激hPDLCs-visfatin。qRT-PCR检测接受与未接受PgLPS刺激的hPDLCs-visfatin中促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和促基质降解因子（EMMPRIN、MMP1、MMP3、MMP13）的mRNA表达变化。 3.Westernblot检测接受与未接受PgLPS刺激的hPDLCs-visfatin中IL-6和EMMPRIN的蛋白表达变化。 4.ELISA检测接受与未接受PgLPS刺激的hPDLCs-visfatin培养上清中TNF-α、IL-1β和MMP1的分泌蛋白浓度变化。 5.收集牙周炎患者的炎症牙龈组织，收集行第三磨牙拔除术患者的健康牙龈组织。应用组织块联合酶消化法处理牙龈组织，分离并培养健康组织来源的hGFs和炎症组织来源的iGFs。 6.qRT-PCR检测分离培养的iGFs中TNF-α、IL-1β和IL-6三种促炎因子的表达水平。 7.对iGFs分别瞬时转染两种siRNA，以获得敲低visfatin表达的iGFs-si。qRT-PCR和westernblot检测两种siRNA敲低visfatin的效果，选择敲低效果更佳者用于后续实验。 8.10μg/mLPgLPS刺激iGFs-si。qRT-PCR检测接受与未接受PgLPS刺激的iGFs-si中促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和促基质降解因子（EMMPRIN、MMP1、MMP3、MMP13）的mRNA表达变化。 9.Westernblot检测接受与未接受PgLPS刺激的iGFs-si中IL-6和EMMPRIN的蛋白表达变化。 10.ELISA检测接受与未接受PgLPS刺激的iGFs-si培养上清中TNF-α、IL-1β和MMP1的分泌蛋白浓度变化。 实验结果 1.相较于对照组，hPDLCs-visfatin中visfatinmRNA表达水平升高约26倍，蛋白表达水平升高约1.7倍。 2.在不接受PgLPS刺激的情况下，hPDLCs-visfatin中TNF-α、IL-1β、IL-6和EMMPRIN的mRNA表达水平与对照组相比无统计学差异；MMP1、MMP3、MMP13的mRNA表达水平显著上升。在PgLPS的刺激下，hPDLCs-visfatin中TNF-α、IL-1β、IL-6、EMMPRIN、MMP1、MMP3、MMP13的mRNA均显著上升。 3.Westernblot结果显示，在不接受PgLPS刺激的情况下，hPDLCs-visfatin中IL-6的蛋白表达水平较对照组无统计学差异，EMMPRIN的蛋白表达水平较对照组显著上升；在PgLPS的刺激下，hPDLCs-visfatin中IL-6和EMMPRIN的蛋白表达水平均显著上升。 4.ELISA结果显示，在不接受PgLPS刺激的情况下，hPDLCs-visfatin培养上清中TNF-α和IL-1β的分泌蛋白浓度较对照组无统计学差异，MMP1的浓度较对照组显著上升；在PgLPS的刺激下，hPDLCs-visfatin培养上清中TNF-α、IL-1β和MMP1的蛋白浓度均显著上升。 5.相较于hGFs，iGFs中TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达水平更高。 6.相较于对照组，iGFs-si-1中visfatinmRNA表达水平约为0.18倍，蛋白表达水平约为0.71倍；iGFs-si-2中visfatinmRNA表达水平约为0.063倍，蛋白表达水平约为0.36倍。iGFs-si-2的visfatin敲低效果更为显著，选择其用于后续实验。 7.qRT-PCR结果显示，在不接受PgLPS刺激的情况下，iGFs-si-2中TNF-α、IL-1β、IL-6、EMMPRIN、MMP1、MMP3、MMP13的mRNA表达水平与对照组相比均无统计学差异；在PgLPS的刺激下，iGFs-si-2中TNF-α、IL-1β、IL-6、EMMPRIN、MMP1、MMP3、MMP13的mRNA水平均显著下降。 8.Westernblot结果显示，在不接受PgLPS刺激的情况下，iGFs-si-2中IL-6和EMMPRIN的蛋白表达水平较对照组均无统计学差异；在PgLPS的刺激下，iGFs-si-2中IL-6和EMMPRIN的蛋白表达水平均显著下降。 9.ELISA结果显示，在不接受PgLPS刺激的情况下，iGFs-si-2培养上清中TNF-α和IL-1β的分泌蛋白浓度较对照组无统计学差异，MMP1的浓度较对照组显著下降；在PgLPS的刺激下，iGFs-si-2培养上清中TNF-α、IL-1β和MMP1的分泌蛋白浓度均显著下降。 结论 1.在无PgLPS刺激的正常培养状态下，内源性visfatin可调节牙周细胞中促基质降解因子的表达，但未能影响促炎因子的表达； 2.在PgLPS创造的炎性微环境下，内源性visfatin可调节牙周细胞中促炎因子与促基质降解因子的表达。 第四部分：Visfatin调控牙周膜细胞炎症反应的信号转导机制 实验目的 探究visfatin调控hPDLCs中炎症反应的信号转导机制，检测visfatin是否通过NF-κB信号通路和IRE1α通路介导牙周炎症的发展。 材料与方法 1.Westernblot检测接受与未接受PgLPS刺激的hPDLCs-visfatin中NF-κB信号通路核心分子p65磷酸化水平的变化。 2.用NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082处理hPDLCs-visfatin。Westernblot检测IL-6、EMMPRIN和visfatin蛋白表达水平的变化。ELISA检测MMP1分泌蛋白浓度的变化。 3.将16只八周龄C57小鼠随机分为：健康组、牙周炎组、PBS组和KIRA6组。除健康组外，利用丝线结扎的方法于小鼠上颌第二磨牙构建实验性牙周炎模型。同时，对KIRA6组的小鼠进行腹腔注射IRE1α通路抑制剂KIRA6，对PBS组小鼠按相同剂量腹腔注射PBS，每48h注射一次。7天后收集所有小鼠上颌骨，于体视显微镜下观察并测定上颌第二磨牙六个位点釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离，进行Micro-CT扫描并通过对骨体积/总体积、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分离度等参数定量分析牙槽骨吸收情况。 4.Westernblot检测接受与未接受PgLPS刺激的hPDLCs-visfatin中磷酸化IRE1α水平的变化。 5.用IRE1α通路抑制剂KIRA6处理hPDLCs-visfatin。Westernblot检测IL-6、EMMPRIN和visfatin蛋白表达水平的变化。 实验结果 1.在不接受PgLPS刺激的情况下，与对照组相比，hPDLCs-visfatin中磷酸化p65蛋白水平显著升高。加入抑制剂BAY11-7082培养的hPDLCs-visfatin中IL-6蛋白水平与其余组别相比无统计学差异；与未加抑制剂组相比，加入抑制剂培养的hPDLCs-visfatin中的EMMPRIN和磷酸化p65蛋白表达水平明显受到抑制，但EMMPRIN的蛋白水平仍与未加入抑制剂培养的对照组存在差异。ELISA结果显示，抑制剂BAY11-7082处理可显著降低hPDLCs-visfatin培养上清中MMP1的分泌蛋白浓度，但仍与未加入抑制剂培养的对照组存在差异。 2.在PgLPS刺激下，与对照组相比，hPDLCs-visfatin中磷酸化p65蛋白水平显著升高。与未加抑制剂组相比，加入抑制剂BAY11-7082培养的hPDLCs-visfatin中IL-6、EMMPRIN和磷酸化p65的蛋白表达受到明显抑制，但EMMPRIN和磷酸化p65的蛋白表达水平仍与未加入抑制剂培养的对照组存在差异。 3.体视显微镜与Micro-CT三维重建结果显示，与健康组小鼠相比，牙周炎组小鼠上颌第二磨牙、第一磨牙远中、第三磨牙近中牙槽骨吸收明显，第二磨牙区骨体积/总体积、骨小梁数量、骨小梁厚度均有显著降低，骨小梁分离度显著升高。牙周炎组与PBS组的各参数之间统计学无差异。KIRA6组与牙周炎组和PBS组相比，第二磨牙区牙槽骨吸收程度显著减轻，骨体积/总体积、骨小梁数量、骨小梁厚度均有显著升高，骨小梁分离度分离度显著下降，但与对照组相比仍有差异。体外研究中，westernblot结果显示，无论是否存在PgLPS刺激，与对照组相比，hPDLCs-visfatin中磷酸化IRE1α含量显著升高。与未加抑制剂组相比，IL-6、EMMPRIN和磷酸化IRE1α在加入抑制剂培养的hPDLCs-visfatin中的表达受到明显抑制，但EMMPRIN的表达水平仍与未加入抑制剂培养的对照组存在差异。 结论 1.Visfatin部分通过NF-κB信号通路调控牙周膜细胞炎症反应； 2.体内研究证实抑制IRE1α通路可有效抑制牙周炎小鼠的牙槽骨吸收，体外研究证实visfatin部分通过IRE1α信号通路调控牙周膜细胞炎症反应。
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